第四代基因组测序技术讲课.pptxVIP

纳米孔基因测序技术;; 纳米孔基因测序技术;;MinION的尺寸之小，只有一支笔的长度，重大约100克，MinION完全颠覆了测序仪的形象，MinION直接通过USB链接到笔记本上，原始的电流信号通过网络传到英国的服务器上，进行读取。一个MinION有500个纳米孔在并行测序，每个孔每秒测30bp，因此，要测到1G的数据，需要3天时间。; 纳米孔;前提条件：（ⅰ) 每个核苷酸都有其特有的电流阻塞信号; (ⅱ) 纳米孔具有合适的几何尺寸, 一次只容纳一个碱基通过; (ⅲ) 电流分辨率足以检测核苷酸的移动; (ⅳ) 核苷酸分子的运动必须是单向的; (ⅴ) 纳米孔与薄膜之间的组合应当足够牢固以适应实验所需的温度和化学环境.; 隧道电流对DNA分子经过电极时的位置、方向十分敏感,所以即使非常微小的差异也会引起隧道电流的变化, 如何控制DNA分子准确、单一方向地通过纳米孔也很难。 电容检测法作为一种可能的电学解决方案,也有研究者对此进行了研究,当单个碱基通过纳米孔时,其自身所带电荷会引起纳米电容上的电荷量发生变化,从而可以检测到电压的变化,理论上4种不同的碱基所带电荷不同,引起的电压变压也会有所差异,因此可以用于DNA的测序.在绝缘体上硅衬底上制作出poly-SiO2-Si结构的纳米电容,来检测碱基通过纳米孔时引起的电压波动, 通过仿真验证了采用电容的电压波动分辨单个碱基信息的可能性,通过仿真给出了C, A, T, G 4种碱基单独穿越纳米孔时引起的电压波动的变化。可以看出, C, A, G 3种碱基的电压曲线较为相近,有一个峰值和一个谷值,与单个偶极子穿越纳米孔引起的电压波动类似,而T的电压曲线可区分度较高,有1个峰值和2个谷值.图中得到的结果是脱离DNA骨架的单个碱基得到的结果, 实际在测量单个碱基过程中得到的电压值会受到DNA骨架、附近碱基和溶液离子的影响, 因此在碱基识别的准确度上还有很多需要研究的问题.; 荧光测序DNA序列信息转换成两种颜色的图形信息，然后再通过光学读出技术进行检测、分析。然而，要将荧光探 针标记到DNA链中的每一个碱基上是非常困难的工作。于是人们开发出了一种新的方法，使用合成DNA和光读取技术测序。待测DNA链中的每一个核苷酸都被替换成更长的由橙色和蓝色碱基组成的寡聚体，每一个待测核苷酸都被12bp的寡聚体替代。将这种转换后的新 DNA链与分子信标杂交。杂交链在通过纳米孔时分子信标会脱落，释放出荧光，读取这些荧光就可以推测出原始 DNA链的序列。用两种不同的12 碱基寡聚体（12-mer oligos）——A和B，按照四种不同的组合方式（AB、BA、AA、BB）将A、B组合起来，这样就可以对DNA链中的每一个核苷酸进行替换了。因为单个核苷酸通过纳米孔的速度实在是太快了，完全无法进行检测，所以将单核苷酸替换成这种长一点的寡聚体，可以减缓通过速度，方便检测。同时，通过这种信号转化还将DNA链中原本的四种信号A、T、G、C简化成了A、B两种信号。挪威Lingvitae公司已经成功开发出了一种自动化的、大规模并行处理方法。该方法可以在24小时内将一个人类基因组序列转化成由24bp寡聚体序列组成的“新”序列。; 缺陷;;THANKS