双萤光素酶报告基因技术详解.ppt

Report Smartly －萤光素酶报告基因技术 自然界的萤光 自然界的萤光 报告基因的作用 细胞信号转导途径 启动子/增强子 受体结合 病毒/细胞相互作用 转录因子 药物诱导作用或”效果” 各种报告基因的优点和缺点 萤光素酶报告基因的主要优点 非放射性 检测快（比CAT等） 灵敏度高（可比CAT检测灵敏度高100倍） 半衰期短（在理想条件下，可检测到10-20 摩尔的萤光素酶分子。在哺乳动物细胞中半衰期3小时，在植物细胞中半衰期3.5小时。而CAT在哺乳动物细胞中的半衰期约50小时） 线形范围广 （在10-16 M 10pg/L 至10-8 M 1mg/L 范围内,光强度与萤光素酶浓度成正比） 一般比显微镜检测的荧光更灵敏 对多孔板而言 生物萤光比荧光更稳定,因为自然界进化的酶能保护光子发射器 通过基因工程可以延伸生物萤光的性能和能力 萤光素酶报告基因的使用 原理: 制备含有 luc/ Rluc 的DNA 转染 提供刺激 测量萤光 在活细胞中做报告基因检测 启动子/增强子分析 “碰撞启动子”: 全序列: 2 逐步缺失: 萤火虫生物萤光的化学 海肾萤光素酶反应 Enzyme structures 为什么要使用双报告基因 细胞可能有内源脱乙酰基酶 ?-Gal 或 GUS 活性.  CAT, ?-Gal 和 GUS 检测是终点检测.  不能同时对在一个管中组合了萤光素酶和CAT,或?-Gal ,的两个报告基因的检测都灵敏而快速． 双萤光素酶报告基因系统比用CAT和?-Gal做内对照的优点 速度 样品不需预处理，不需孵育。两次检测在几秒种内完成 灵敏 两个萤光素酶的线性范围超过7个酶浓度数量级。内源萤光素酶背景极低 方便 一管完成检测，样品不必分份 数据处理举例 第一天 萤光素酶活性 RLU 比率 归一的活性 样品处理重复 Ｆ Ｒ （F:R 变化倍数 对照 １ 5,128 2,511 ２ 7,553 3,815 ３ 10,555 5,413 7,745 3,913 1.98 1.00 处理Ａ １ 5,1376 4,467 ２ 40,712 3,574 88,787 7,654 6,0292 5,232 11.52 5.82 处理B 1 587,635 5,144 988,347 8,832 3 409,881 3,564 661,954 5,847 113.21 57.18 第二天 对照 １ 15,529 20,433 0.76 ２ 21,897 30,841 0.71 10,760 13,620 0.79 16,062 21,631 0.74 1.00 处理Ｃ １ 850,239 20,843 ２ 578,951 14,830 ３ 943,873 21,788 791,021 19,154 41,30 55,81 处理D 1 14,865 19,3-05 8,967 12,284 13,767 20,246 12,533 17,278 0.73 0.99 GloMax ? 20/20　Single tube luminometer GloMax ? 96 luminometer White microplates for luminescence Promega公司出品的双报告基因实验产品 质粒 萤火虫萤光素酶质粒 海肾萤光素酶质粒 叩头虫萤光素酶质粒 检测系统 非均质双报告基因检测系统（通量较低） 均质的双报告基因检测系统（适合高通量，自动化） 载体 - 萤火虫萤光素酶载体 pGL3-Basic Map pGL3-Control Map pGL3-Enhancer Map pGL3-Promoter Map 辅助报告基因的相对萤光单位 RLU 启动子交叉交谈或互相干扰 实验刺激给辅助报告基因的不必要的调节 载体 - 海肾萤光素酶报告基因载体 用萤火虫和海肾两个萤光素酶做报告基因 Dual-Luciferase? 双萤光素酶报告基因系统（非均质检测） E1910，100次 E1960，E1980，1000次 Dual-GloTM 萤光素酶检测系统 （均质检测） E2920，10ml E2940，100ml EE2980，10X100ml 均质检测与非均质检测 Dual-Luciferase?报告基因检测系统组分 检测缓冲液II 底物（冻干粉） StopGlo?缓冲液 StopGlo?底物,50X 被动裂解液,5X Dual-Luciferase?报告基因检测步骤 裂解细胞 被动裂解 除去培养基..PBS洗..加1XPLB,