如何构建质粒克隆分析.ppt

如何构建质粒克隆 周鸿雁 2011.06.15 pCMVSPORT6 MCS 构建过程 ★ 设计引物 (增加酶切位点, BglⅡ, EcoRⅠ) 目的基因PCR 双酶切载体 (BglⅡ, EcoRⅠ) 琼脂糖凝胶电泳 DNA 胶回收 ( 基因 ,载体) 双酶切目的基因 (BglⅡ, EcoRⅠ) 目的基因与载体相连 DH5α转化 鉴定 第一步：设计目的基因PCR引物目的：1）通过PCR方法扩增目的基因2）在目的基因片断两端增加酶加位点 设计引物前需解决的问题 ? 1、选择酶切位点 ? 2、选择保护碱基 ? 3、终止密码子 PEGFP MCS BAX insert sequence atggacgggtccggggagcagcccagaggcggggggcccaccagctctgagcagatcatgaagacaggggcccttttgcttcagggtttcatccaggatcgagcagggcgaatggggggggaggcacccgagctggccctggacccggtgcctcaggatgcgtccaccaagaagctgagcgagtgtctcaagcgcatcggggacgaactggacagtaacatggagctgcagaggatgatt gccgccgtggacacagactccccccgagaggtctttttccgagtggcagctgacatgttttctgacggcaacttcaactggggccgggttgtcgcccttttctactttgccagcaaactggtgctcaaggccctgtgcaccaaggtgccggaactgatcagaaccatcatgggctggacattggacttcctccgggagcggctgttgggctggatccaagaccagggtggttgggacggcctcctctcctactttgggacgcccacgtggcagaccgtgaccatctttgtggcgggagtgctcaccgcctcactcaccatctggaagaagatgggctga AGATCT ---- BglⅡ buffer 3 GAATTC ----EcoR I buffer 3 酶切位点保护碱基 protection seqence: GGAAGATCTTCC 2h=25%, 20h90% CCGGAATTCCGG 2h90%, 20h90% cggcgg tgatggacgg gtccggggag cagcccagag gcggggggcc Primer1 ATGGACGGGTCCGGGGAGCAG (length ---21, GC%---71.8%, Tm---71.4) ggag tgctcaccgc ctcactcacc atctggaaga agatgggctg aggcccccag Primer2 TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG (length ---25, GC%---52%, Tm---68.4) 引物中是否应包含终止密码子？ 加入保护碱基及酶切位点 Primer 1 GGAAGATCT ATGGACGGGTCCGGGGAGCAG Primer 2 CCGGAATTC TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG 荧光表达在前时(EGFP) Primer1 GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGAGCAG Primer2 CCGGAATTCTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG 因TGA为终止密码子，所以之后的移码不需理会 荧光表达在后时 (DsRed) Primer1 CCGGAATTCatggaggcgctaattcctgtc Primer2 CGCGGATCCCGccaaagatgagtctcccgg 荧光表达在后时需加KOZAK 序列 Primer1 CCGGAATTCgccaccatggaggcgctaattcctgtc Primer2 CGCGGATCCCGccaaagatgagtctcccgg KOZAK 序列: gccacc, 加在起始密码子之前 Primer final Primer1 GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGAGCAG Primer2 CCGGAATTCTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG 第二步：PCR目的基因 第三步：双酶切载体 第四步：琼脂糖凝胶电泳、凝胶回收 0.6% gel