细胞的转染技术解释.pptx

细胞转染技术 原理：细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为一种电容，其静膜电位（Vm）约为l00mV，导电性很差。当把细胞置于外加电场中时，会使膜电位升高，双分子层两端电压形成差势，随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩变薄，当膜电压升到一定数值时，膜被击穿。 可逆击穿：击穿小孔可在一定时间内复原。 不可逆击穿：击穿小孔不可修复，处理细胞成活率低。 操作程序： 将盛有细胞和DNA混合物的特制小容器置于电脉冲仪的正负极之间，在0度下加高压（2～ 4KV），电脉冲10分钟后，将待处理的细胞转移到新鲜培养基中生长2天，再进行筛选。存活细胞的回收率约为60%～ 80%。 首先利用微小的金、钨等金属颗粒相DNA吸附，然后在高压作用下将DNA伴随金颗粒高速进入细胞，由于微粒的直径一般在0.5-0.9 Fm之间，远小于细胞。 因此可直接将DNA导入细胞质中，这种方法能有效地使DNA在活体组织、贴壁细胞和悬浮细胞中表达。由于该方法的高转染效率，通常只得少量DNA即可获得外源基因的表达并激发有效免疫应答。 首先将钨、金微粒(直径约0.4μm，重量约0.05mg)与供体DNA溶液(1～2μl)混合并保温，使DNA吸附在金属微粒的表面，然后将该溶液置于所谓的“基因枪”仪器中，仪器高压放电将金属微粒加速，直接喷射受体原生质或细胞，细胞击穿成孔后，在钨粒上的DNA以及溶液中的DNA都可以进入受体细胞。 操作技术程序为： 裸DNA直接注射 1990年Wolff等首次注意到给小鼠直接肌肉注射纯化的DNA或RNA重组表达载体，可使载体上的基因在局部肌细胞内表达，这种表达可持续数日或更长时间，且没有检出注射的外源核酸与宿主染色体整合。 随后的大量动物实验都说明在合适的条件下，DNA接种后可诱导机体产生细胞及体液免疫。于是，作为一种新的基因治疗手段——核酸免疫技术应运而生。 基因表达 1. Prokaryotic expression vector 原核表达载体 2. Baculovirus expression vector 昆虫杆状病毒表达载体 3. Mammalian expression vector 哺乳动物表达载体 4. Adenoviral and retroviral vector 腺病毒及逆转录病毒表达载体 Prokaryotic expression vector 原核表达载体 GST-fusion 6xHis-fusion GST HIS 基因功能研究 Overexpression in cells 超表达，观察表型 RNAi 干扰技术 Yeast two hybrid system 酵母双杂交等技术寻找与目的基因相关的蛋白 Protein expression and antibody preparation表达蛋白与抗体制备 Localization of protein 蛋白在细胞中的定位 The Construction of Adenovirus Vectors Background Recombinant adenoviruses currently are used for a variety of purposes, including gene transfer in vitro, vaccination in vivo, and gene therapy . The genome of the most commonly used human adenovirus (serotype 5) consists of a linear, 36-kb, double-stranded DNA molecule. Both strands are transcribed and nearly all transcripts are heavily spliced. Viral transcription units are conventionally referred to as early (E1, E2,E3, and E4) and late, depending on their temporal expression relative to the onset of viral DNA replication . In most recombinant vectors, transgenes are introduced in place of E1 or E3, the former supplied exogenously. The E1 deletion renders the viruses defective for replication and incapa