第四章蛋白质化学分析.ppt

水溶性卟啉 水溶性卟啉，如?,?,?,?- 4(对磺苯基)卟啉(TPPS4)和?,?,?,?- 4 (对羧苯基)卟啉(TCPP)是性能优良的蛋白质荧光探针。利用微量蛋白质对TPPS4的荧光熄灭作用，可以测定纳克级的蛋白质。 酸性条件下，TCPP本身荧光很弱，一定量的白蛋白可使TCPP荧光增强，但球蛋白的增强作用不明显，当有ＳＤＳ存在时，白蛋白和球蛋白对TCPP的荧光增强作用均增加，基于这一现象，可以利用1个测定体系分别测定白蛋白和球蛋白。 2）稀土荧光探针 稀土荧光探针法为蛋白质的研究工作开辟了一条新的途径。铕(III)和铽(III)是最常用的两种稀土荧光探针。 铕(III)和铽(III)荧光光谱的高灵敏性和不同环境对荧光的影响，使得铕(III)和铽(III)成为研究蛋白质的有效探针。 铕(III)或铽(III)荧光寿命的测定能够给出蛋白质分子的构象及构象动力学方面的信息。 Austin等使用Tb(III)为探针研究了钙调蛋白的构象动力学。另外稀土螯合物也可以作为荧光探针进行蛋白质的分析，如铽的螯合物已用于蛋白质的定量测定。 * （2）金属离子沉淀法 一些高价金属离子对沉淀蛋白质很有效。它们可以分为三类： 1.第一类为Mn2+，Fe2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+和Cd2+能和蛋白质分子表面的羧基，氨基、咪唑基、胍基等侧链结合。 2.第二类为Ca2+，Ba2+，Mg2+和Pb2+能和蛋白质分子表面的羧基结合。 3.第三类为Ag+，Hg2+和Pb2+能和蛋白质分子表面的巯基相结合。 金属离子沉淀法的优点 金属离子沉淀法的优点是它们在稀溶液中对蛋白质有较强的沉淀能力。处理后残余的金属离子可用离子交换树脂或螯合剂除去。 在这些离子中，应用较广的是Zn2+，Ca2+，Mg2+，Ba2+和Mn2+，而Cu2+，Fe2+，Pb2+，Hg2+等较少应用，因为它们会使产品损失和引起污染。Zn2+可用于沉淀杆菌肽(作用于第4个组氨酸残基上)和胰岛素；Ca2+(CaCO3)用于分离乳酸，血清清蛋白等。 2.有机物沉淀 利用和水互溶的有机溶剂使蛋白质沉淀的方法很早就用来纯化蛋白质。加入有机溶剂于蛋白质溶液中产生多种效应，这些效应结合起来使蛋白质沉淀。其中主要效应是水活度的降低。 当蛋白质溶液pH小于其等电点时，蛋白质颗粒带有正电荷，容易与酚类化合物或有机酸酸根所带的负电荷发生作用生成不溶性盐而沉淀。 这类化合物包括鞣酸（又称单宁）、苦味酸（即2,4,6-三硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水杨酸等。 如，PEG,合成高分子等 （1）有机溶剂 （2）酚类化合物及有机酸沉淀 （3）聚电解质沉淀法 有机溶剂沉淀法的优缺点 有机溶剂沉淀法的优点是溶剂容易蒸发除去，不会残留在成品中，因此适用于制备食品蛋白质。而且有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，便于离心分离。有机溶剂沉淀法的缺点是容易使蛋白质变性失活，且有机溶剂易燃、易爆、安全要求较高。 一般所选择的溶剂必须能和水互溶，而和蛋白质不发生化学反应，最常用的溶剂是乙醇和丙酮，加量在20%-50%（V/V））之间。当蛋白质的溶液pH接近等电点时，引起沉淀所需加入有机溶剂的量较少。 3. 等电点沉淀 蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 pH对乳球蛋白溶解度的影响 等电点沉淀法的优缺点 等电点沉淀法的一个主要优点是很多蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常价较廉，井且某些酸，如磷酸、盐酸和硫酸的应用能为蛋白质类食品所允许。同时，常可直接进行其他纯化操作，无需将残余的酸除去。 等电点沉淀法的最主要缺点是酸化时，易使蛋白质失活，这是由于蛋白质对低pH比较敏感。 4.2 化学物质对蛋白质的变性及稳定作用 蛋白质的稳定性 在生物体内，蛋白质（酶）分子处于一个极其复杂的体系中，其周围的磷脂膜、其它的蛋白质、代谢物、金属离子等使蛋白质分子保持相对稳定状态。 蛋白质的稳定性是指蛋白质抵抗各种因素的影响，保持其生物活性的能力。 根据生物体内蛋白质等存在的状态，可以利用化学物质或化学方法使蛋白质稳定化，以有利于蛋白质在体外的应用。 通过研究蛋白质的变性及稳定性，可以了解蛋白质的结构功能与稳定性的关系等。 4.2.1蛋白质不可逆失活的化学因素 1.强酸和强碱 强的无机酸碱及有机酸碱都可以改变蛋白质溶液的pH，引起蛋白质表面必需基团的电离，由于各氨基酸残基所带电荷的相互吸引或排斥使蛋白质的空间结构发生较大变化，造成蛋白质分子聚集，导致不可逆失活。 另外，在强酸、强碱条件下，肽键也容易被水解断裂，天冬酰胺和谷酰胺侧链的酰胺会发生脱氨作用，改变了原来蛋白质表面的电荷分布，使蛋白质构象重