血红蛋白的提取选修一资料.pptVIP

课题三 血红蛋白的提取和分离 2 原理 由 构成的凝胶，内部有许多贯穿的 。 【巩固】 凝胶色谱法分离蛋白质的原理依据是 A．根据蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小 B．根据蛋白质相对分子质量的大小 C．根据蛋白质所带电荷的多少 D．根据蛋白质溶解度的大小 1 概念 指 在电场的作用下发生 的过程。 2 原理 在一定的 下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上 或 ，在电场的作用下，这些带电分子会向着 的电极移动。 3 作用 电泳利用了待分离样品中各种分子 的差异及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中 。 4 方法 常用的电泳方法 有 和 。测定蛋白质分子量时 通常使用 。 [思维激活] 凝胶色谱法和电泳法在实现分子分离的原理方面有何不同？ 1．蛋白质的提取和分离一般分为四步： 、 、 和 。 A 样品处理及粗分离 1 红细胞的洗涤 采集血样， ，吸取血浆后加 ，再低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色。 目的是除去杂质，以利于后续步骤的分离纯化。 2 血红蛋白的释放 将洗涤好的红细胞依次加入 至原血液体积、40%体积的 ，置于磁力搅拌器上搅拌10 min，使红细胞吸水 ，血红蛋白释放出来。 3 分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合液转移到 中，以2 000 r/min的速度 10 min。使血红蛋白和其他杂质分离开，便于下一步对血红蛋白的纯化。 分离血红蛋白溶液 B 凝胶色谱操作 1 凝胶色谱柱的制作：准备材料→加工橡皮塞→安装 。 2 凝胶色谱柱的装填。 3 样品的 。 样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A． 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面 B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内 C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 D．用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面 最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。 血红蛋白有什么特点？ 这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？ [归纳整合]蛋白质的提取和分离 1.知道凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子技术的基本原理。 2.掌握血红蛋白提取和分离的基本过程。 （预习教材15分钟） 学习目标 思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？ 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。 思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？ 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。 1．凝胶色谱法 1 概念 也称做 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。 分配色谱法 相对分子质量的大小 凝胶是什么？ 多孔球体 通道 1．凝胶色谱法 当 不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 。而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 ，从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以 。 相对分子质量 较小 较长 较慢 较大 凝胶外部 较短 较快 分离 【例】 下图中，可表示为相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的移动过程的是 B B 2. 缓冲溶液 1、作用： 能够抵制（ ） 对溶液的（ ）的影响，维持PH 基本不变。 外界的酸或碱 PH值 在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是（ ），目的是利用缓冲液模拟细胞内的（ ），保证血红蛋白的正常（ ），便于观察红色和材料的科学研究活性。 磷酸缓冲液 PH环境 结构和功能 2. 缓冲溶液 带电粒子 迁移 pH 正电 负电 与其所带电荷相反 3． 电泳 带电性质 大小 形状 迁移速度 各种分子的分离 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 3． 电泳 使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异 提示　凝胶色谱法分离分子是依据分子质量大小，利用凝胶色谱柱使大分子优先洗脱出来，而小分子后分离出来。 电泳法分离分子则是依据各种分子带电性质的差异，以及分子本身的大小，形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现在电场中将各种分子分离。 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 血红蛋白提取和分离的实验操作 实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠 血红蛋白提取和分离的实验操作 样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定 低速短时间离心 生理盐水 蒸馏水 甲苯 涨破 离心管 离心 血红蛋白提取和分离的实验操作 有机溶剂 （无色透明的甲苯层）