第1节 克隆操作中使用的工具酶1.ppt

第一节 基因操作工具酶 第二节 核酸的分离纯化第三节 聚合酶链式反应（PCR）第四节 凝胶电泳系统第五节 核酸的分子杂交第六节 载体系统 第一节 基因操作工具酶 主要内容 1 限制性核酸内切酶 2 DNA连接酶 3 DNA聚合酶 4 修 饰 酶 5 小 结 1 限制性核酸内切酶 1.2 命 名 命名原则： 第一个字母（大写, 斜体）： 该酶来源的微生物属名； 第二、三个字母（小写、斜体）：微生物种名； 若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个字母（大写） 若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。 1.3 分 类 1.3.1 Ⅰ 型限制性内切酶 1.3.2 Ⅱ 型限制性内切酶 1.3.3 Ⅲ 型限制性内切酶 1.3.1 Ⅰ型限制性内切酶 功能：限制、修饰 特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；识别位点和切割位点不一致，无固定切割位点； 应用：不常用。 1.3.2 Ⅲ型限制性内切酶 功能：限制、修饰 特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；特异切割，切割位点在距识别位点3`端24-26 bp处。 应用：数量很少，无实际作用。 1.3.3 Ⅱ型限制性内切酶 功能：识别并特异切割DNA分子。 即通常所指DNA限制性核酸内切酶； 反应特点：仅需 Mg2+ 作催化反应辅助因子，能识别双链DNA特殊序列，并可特异切割DNA，产生特异片段； 应用：种类繁多，分子克隆中最为常用 (1) 基本特性 识别长度为4-8个核苷酸的特异序列； 许多识别序列具回文结构，如Hind Ⅲ 的识别序列： 5` AAGCTT 3` 3` TTCGAA 5 切割产生末端有粘端 (cohesive/sticky end) 如BamH I (G↓GATCC) 和平端 (blunt end) 如Sma I (CCC ↓GGG) (2) 同功异源酶(isoschizomer) 来源不同但能识别和切割同一位点的酶。又称同裂酶。 如：BamH I (G↓GATCC)和Bst I (G ↓GATCC) 注：有一些同功异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感度有所不同。 (3) 同尾酶（isocaudamer) 识别序列不同，但产生相同粘性末端的限制酶。 如：BamH I : G↓GATCC Bgl II : A↓GATCT 1.4 活性及影响因素 (3) 影响因素 ① DNA模板的纯度 ② DNA的甲基化程度 ③ 酶切反应温度 ④ DNA的分子结构 ⑤ 缓冲液 2 DNA连接酶 2.1 定义及功能 2.2 种类及作用机理 2.3 使用时的注意事项 2.1 定义及功能 DNA连接酶（DNA ligase）： 可使一段DNA 3`-OH末端和5`-P 末端形成3`,5`-磷酸二酯键，把两DNA片段连在一起封闭双链上形成的切口的酶。 两类: ◆T4 DNA连接酶(ATP提供能量） ◆ 大肠杆菌DNA连接酶（NAD+提供能量） 1)不能催化两单链DNA分子连接； 2)只能连双链DNA分子的单链缺刻(nick)；不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致缺口(gap)。 3 DNA聚合酶（DNA polymerase） 3.1 DNA聚合酶 I 3.2 Klenow聚合酶 3.3 Taq DNA聚合酶 3.4 逆转录酶 3.5 T4 DNA聚合酶 3.6 T7 DNA聚合酶 3.1 DNA聚合酶 Ⅰ 活性： 5`→3`聚合活性，5`→3`外切和3`→5` 外切活性。 发挥生物学活性的条件： （1）DNA模板（可以是单链或双链） （2）带有3`-端游离羟基的引物链 （3）底物和激活剂 注：对双链DNA，当有dNTP存在时， 3`→5`降解活性会被5`→3`方向的聚合活性所抑制。 应用：缺口平移法制备DNA分子杂交探针 3.2 Klenow聚合酶 活性： 5`→3`聚合活性，3`→5` 外切酶活性，无5`→3` 外切酶活性。 用途： （1）填补或标记DNA的3`隐蔽末端； （2）催化合成cDNA第二链； （3）DNA序列测定 3.3 Taq DNA聚合酶 显著特点：热稳定性。70℃反应2h残留活性90 %； 93℃ 反应 2 h残留活性60% ；94℃ 反应 2 h残留活性40%。 应用：（1）对DNA的特定片段进行体外扩增； （2） DNA序列测定。 3.4 逆转录酶 逆转录酶 (reverse transcriptase)：