2-1章分子克隆载体课程.pptVIP

第二章 分子克隆载体 第一节 分子克隆载体的特点 分子克隆载体的功能: 为外源基因提供进入受体细胞的转移能力 为外源基因提供在受体细胞的复制能力或整合能力 为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力 三种表达型载体结构图 显然, 不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基因提供。换言之,被表达的外源基因一旦确定, 表达载体的类型也就确定了。 例子：pTrcHis2和pPIC9K 4) 用途: a. 表达外源基因以产生大量外源基因产物 b. 用于构建cDNA文库 5)??注意事项: a. 启动子来源 b. 终止子来源 c.?启动子的启动效率 d.信号肽来源与结构 e. 调控类型 * * 分子克隆载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子。 一、发展概况 1.??第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al) 2.??第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。 3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。 二、载体特点 1. 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。 2.?至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。 3.?至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞 大肠杆菌载体 pBR322结构图 三、遗传标记基因 1. 标记基因的作用 1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞 这种指示可以是选择性的（Apr ，Tcr ，Kanr），也可以是非选择性的（如lacZ） 2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。 * 这种指示也可以是选择性的（如TcS），也可以是非选择性的（如TcS， lacZα, GUS），绝大多数为后者。 **有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采用非选择性的—检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因（lacZ，GUS等）。 2.?标记基因的种类 1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子） a.? 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r，Hygr ，Neor b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cd r c. 代谢抗性基因: TK，抗除草剂基因 2）营养标记基因（可直接用于选择转化子） 主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因， 这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。 3）生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ, GUS, CAT 4） 噬菌斑 3.?使用标记基因注意要点 1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始序列, 密码子偏爱性 4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS 4.??常用的遗传标记基因 1) 四环素抗性基因（Tcr） Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。 2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr） Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β—内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。 3) 氯霉素抗性基因（Cmr） Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。 4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r