【新步步高】2014-2015学年高二生物浙科版选修1课件：4.12 乳酸脱氢酶同工酶的分离 .pptxVIP

第四部分 浅尝现代生物技术实验12 乳酸脱氢酶同工酶的分离;实验原理;垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳;AP-TMTED催化体系 ; 化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素的影响：; 凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响 ; 凝胶的总质量浓度T和交联度C决定凝胶的有效孔径。凝胶的三维网状结构具有分子筛效应，不同大小和形状的大分子通过孔径时所受的阻滞力不同，加上大分子的电荷效应，使各种大分子迁移率不同得以分离。在实际工作中，常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度，使蛋白质混合物得到最大限度的分离，大多数蛋白质在7.5%凝胶中能得到满意的结果，所以这个浓度的凝胶称为标准胶。当分析一个未知样品时，常用标准胶或梯度凝胶来测试，而后确定适宜的凝胶浓度。 ;净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理 ;蛋白质在净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素 ;聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型;;关于乳酸脱氢酶;乳酸脱氢酶同工酶活性染色;;电泳装置;;操作步骤;二、制备凝胶： 凝胶模的组装 凝胶模由一块玻璃板、一块凹形氧化铝板和两条间隔条组成，将它们按下图组装，四周对齐，注意手指勿接触玻璃和氧化铝板内侧的灌胶面，注意间隔条的安装。;将凝胶模安装在固定架上 将凝胶模插入固定架， 使凹形氧化铝板紧贴固定 架的背板，将固定架放在 一个水平玻璃板上，使凝 胶模各部件与固定架下缘 对齐，轻轻拧紧螺丝，使 压条紧压凝胶模。 ;将固定架安装在底座上 将固定架置于凝胶 模底座上，螺丝朝外， 固定架两侧插入凸轮， 凸轮旋转180o使凝胶模 的下缘在固定架的橡胶 垫上压紧，形成一个密 闭的夹心式凝胶模。 ; 制胶(T=7.5%，C=2.6%) 两组按照表中的比例和顺序在小烧杯中配制凝胶溶液，加入AP后，立即混匀，沿玻璃板尽快倒入玻璃板和金属板缝隙中，注意不要有气泡，当凝胶液面距短板（白金属板）上缘0.3 cm时，立即轻轻将样品槽模板插入凝胶溶液中，注意样品槽中不要有气泡，凝胶溶液应充满样品槽间隙。制胶装置室温垂直放置，30~60 min聚合反应完成。 ;制备连续聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配方（两组） ;; 加样 取125mL电极缓冲液贮液，用去离子水稀释到250mL，加入上、下缓冲液槽中，注意上槽液要高过凹形板，凝胶板与下液槽的缝隙处无气泡。将印有样品槽模板形状的塑料片贴在玻璃板上，使其与样品槽重合（加样后电泳前将塑料片取下），小心拔出样品槽模板。用微量进样器吸取一定体积的样品溶液，小心地将样品加在样品槽底部。注意每种样品使用同一支进样器，以免样品相互污染。 ;;四、电泳： 加样后，盖上电泳 槽安全盖，接通电源， 注意正负电极的连接， 将电泳仪调至恒压80 V， 待指示剂全部进入凝胶 后，电压提高到120 V， 继续电泳，直到溴酚蓝 前沿到达距凝胶下端约 0.5 cm时，关闭电源， 停止电泳（本实验可将 溴酚蓝走出0.5h~1h后停 止电泳）。;五、活性染色，脱色，照相： 电泳结束后，将凝胶板取下，用薄尺子轻轻将玻璃板和氧化铝板撬开，在凝胶下部切角标注凝胶方位，然后将带有凝胶的板反扣过来，胶面朝下，用尺子小心地将凝胶的一角剥离，使凝胶掉入装有活性染色液的培养皿中。轻轻摇动培养皿，使凝胶完全浸泡在染色液中，放入37℃恒温水浴中保??，染色过程注意避光，待大多数条带显现蓝紫色时除去染色液，显色时间一般为15~30 min。加入脱色液终止酶促反应，摇动3~5 min，凝胶底色脱去直至背景清亮，数码相机照相。 ; 附：制干胶 用两张玻璃纸将凝胶制成夹心式干胶，待凝胶干透后，取下玻璃板即可得到平整透明的电泳干胶图谱。;其他注意事项