丙种球蛋白的电泳制备重点.pptxVIP

丙种球蛋白的电泳制备;目录;一、基本资料;药理作用;适应症;二、制备丙种球蛋白的方法;实验方法;实训原理;实训器材与试剂;三、操作步骤;（2）、用自动取液器吸取上述配好的分离凝胶贮液沿着小玻管内壁小心准确加入7.0 cm高。 （3）、凝胶溶液加毕后，随即吸取蒸馏水，加至管中的凝胶表面，使其表面覆盖一水层（水封，1.0cm 高）。在灌胶和封水的过程中，操作要轻，以避免产生气泡。 （4）、将加注好的凝胶管于室温下静置，以进行聚合反应，在正常情况下大约30-60分钟后，待界面出现明显分层现象时，表明胶已聚合完毕，即可加浓缩胶。 ;3、灌胶及封胶 将混匀好的胶液，用滴管缓慢注入玻璃管，当加到液面距离电泳玻璃管上口 1cm 时停止。注意在加的过程中不要混进空气，随即用注射器经针头沿凝胶管壁缓慢加入蒸馏水至管满，防止氧化，室温下聚合15-20min。 4、制样 取血清30ul，加0.025%溴酚蓝5ul，20%蔗糖65ul，混匀即可。 ; 浓缩胶的制备：;（3）、加样： 取一根上次做好的凝胶小玻管用吸水纸轻轻吸去浓缩胶表面上的水层，然后用微量注射器加10ul测试样品溶液。 （4）、装置凝胶管： 将加好样品的凝胶管的加样端（上端），插入上电泳槽孔中，然后将已插满凝胶管的上电泳槽放入加有电极溶液的下电泳槽内。此时凝胶玻管下端管口易产生气泡，可通过轻轻摆动凝胶玻管以去除气泡，插入上电泳槽的玻管上端，用滴管轻轻滴满电极溶液，以免产生气泡，最后将上电泳槽装满电极液。; （5）、接通电源： 接通电泳槽的两端电极与电泳仪的电源，内槽装阴极缓冲液,外槽用阳极缓冲液恒压电泳,先40V约1.5h,当样品进入分离胶时,电压升至60V约1.5h。 确定电泳结束时，不应将溴酚兰跑出凝胶管，以防止标准分子量中的最低分子量蛋白质也跑出凝胶管。;6、剥胶 电泳结束后，取下玻璃管，将一支带有长针头的注射器吸有适量水（蒸馏水或自来水），从浓缩胶一端紧贴玻璃管壁缓慢插入针头，一面注入蒸馏水一面缓慢旋转玻璃管。靠水流的压力和润滑作用使凝胶和玻璃管的内壁分开，待水流从另一端流出时，再慢慢将针头退出（注意操作中不要把胶条搅碎）。然后用洗耳球轻轻在胶管的一端加压，将胶条从玻璃管中缓慢滑出。 ; 7、固定 剥胶完毕后，将胶条置于固定液中固定20-30分钟 8、凝胶染色： 将取出的凝胶柱，放入一合适干净的培养皿内，然后加入适量考马斯亮蓝染色液中，于摇床上进行振摇染色30分钟，完毕，回收染色液，用清水洗凝胶柱2-3遍。在染色的同时，凝胶中蛋白质区带亦被固定。; 9、凝胶脱色： 在培养皿（或试管）内加入适量脱色液于摇床上进行振摇（2小时/次，需3次）脱色多次直至色带完全清晰为止。 10、绘图： 最后根据染色所出现的带数和位置进行绘图，以确定被分析样品的组分。另一种方法是通过密度扫描仪扫出各组分的峰形位置，这样不仅能确定组分，而且能比较出各组分所占比例（如果要计算出各分离区带的相对迁移率，可参考教课书）。 ;四、注意事项 ;固体胶切忌倒入水池。 安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正，均匀用力旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏。 电泳后，应分别收集上、下贮槽（正负极）电极缓冲液，切不可混合回收。 丙烯酰??等试剂是有毒试剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。 ;谢谢观看