第四章_超薄切片技术.pptVIP

第四章  超薄切片技术 第一节 基本概念 1、表面镀金（喷镀）技术 2、组织导电技术 3、冷冻断裂技术 4、离子蚀刻技术 5、临界点干燥技术 6、冷冻干燥技术 7、铸型观察技术（复型） 注： 最基本、最经典的还是超薄切片技术 ⑴ 细胞的细微结构保存良好，没有明显的物质凝聚、丢失、添加等人工效应 ⑵ 切片厚度500～700?为宜 ,小于1000 ? 太薄：?高，反差低 太厚：?低，反差好，结构重叠，电子甚至 不 能穿透 ⑶ 切片应耐电子束的强烈照射，不变形，升华 ⑷ 切片能够适当被染色，保证一定的反差 ⑸ 切片均匀，无皱褶、刀痕，无染色剂或其他 化学物质的沉淀 取材→固定→脱水→渗透→包埋→聚合→修块→切片→染色 操作规则:快,小, 冷,准,稳,轻(防损伤) ⑴ 快：动作迅速,快取,投入固定液 ⑵ 小：样品体积小,动1mm3,植宽1，长3～4 ⑶ 冷：0～4℃ ⑷ 准：取的部位准，有代表性、目的性 ⑸ 轻：操作轻巧，避免拉、锯、压 ⑴动物材料 麻醉→解剖→ 戊二醛预固定（ 0～4℃， 2％～5％） 在预冷的玻板上细切（1mm3） →戊二醛前固定 (1～3h) →漂洗（10～30min） → 1％锇酸后固定 (1～2h) ⑵植物材料 叶片宽1，长3～4，有时需脱蜡 根茎果实1mm3 ⑶单细胞：洗去有机成分→固定→预包埋→切块 1、概念：用化学或物理方法迅速将细胞、组织杀死,同时把从细胞间的联系到细胞器的分子结构等全部组织的活体形态、精细结构及其组成真实的保存下来. 2、常用的固定方法 化学方法：锇酸（OsO4), 戊二醛 （C5H8O2), 甲醛(HCHO)，高锰酸钾KMnO4、 重铬酸钾、丙烯醛 物理方法：冷冻，干燥，高温 4、固定的标准 细胞内膜结构线条清晰连续不断，细胞基质无明显溶泡和颗粒凝集 1）组成： 固定液：固定剂＋缓冲液 2）作用： ⑴ 破坏细胞的酶活性系统 ⑵ 稳定细胞物质成分，并保存之 ⑶ 接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收缩或膨胀 ⑷ 在组分的分子之间建立交联，提供骨架稳定细胞器的空间构型 ⑸ 提供一定的电子反差 锇酸缺点： ⑴ 不能固定糖元、碳水化合物、核酸，对微管固定效果差 ⑵ 酶的钝化剂，不能用于细胞化学研究 ⑶ 分子量大,渗透能力差，要求组织块小 ⑷ 固定时间不宜过长 ⑸ 可与乙醇、醛类氧化还原反应生成沉积 ⑹ 有挥发性、剧毒 戊二醛缺点： ⑴ 不保存脂肪 ⑵ 无电子染色作用 ⑶ 对缓冲液的要求严格 1、缓冲液：一种仿效细胞外液成分，对细胞富有生理保护功能的溶液 2、缓冲液主要作用 ⑴ 维持稳定的pH值 ⑵ 提供适当的渗透压 ⑶ 提供适当的离子成分使样品不抽提，不沉淀 3、附加剂： 调节渗透压，NaCL, CaCL2，蔗糖，葡萄糖 储备A液(0.2M):磷酸氢二钠 (Na2HPO4.2H2O)35.61g加水定容1000ml 储备B液(0.2M):磷酸二氢钠 (NaH2PO4.2H2O)27.6g加水定容1000ml 0.1M磷酸缓冲液（PBS），由储备A液(0.2M)和储备B液(0.2M)按上表比例合成，然后稀释定容到100ml。 优点：对细胞无毒害，便宜，易于大量配置 缺点：易产生沉淀，不稳定，易受到细菌污染 ⑴单固定： 戊二醛或锇酸单次固定1～3小时 ⑵双固定： 前固定（戊），漂洗，后固定（锇） ⑶多重固定： 用三种以上的固定剂对样品进行固定 1) 固定液的浓度:戊二醛1-5%,锇酸1-3% 浓度低→固定时间长→细胞质的抽提,组织肿胀 浓度高→易损细胞微结构,OsO4或KMnO4可使蛋 白质分子氧化而断裂 2) 固定液的渗透压： 渗透压低→细胞器或整个细胞膨胀 渗透压高→细胞收缩 3) pH值：植物6.8～7.1,动7.2～7.4 4) 固定的温度：0～4℃ 但低温对细胞微丝、微管有害 5) 组织块的大小：0.5～1mm3 6) 固定液的用量，一般为组织块的500倍 三 脱水(dehydrate) 四 渗透与包埋 目的：使包埋剂逐步渗透到组织细胞内部,以便与 细胞外的包埋剂同时聚合，以保证切出优质 的超薄切片。 步骤：渗透，包埋，聚合 （一）、渗透（Infiltrate) 渗透：用另一种溶液或混合液逐渐取代组织内的脱 水剂（或前介质），