蛋白质表达解答.pptVIP

克隆方案I：分泌表达含有天然N端蛋白质 克隆方案II：分泌表达含有非天然N端的蛋白质 克隆方案III：分泌表达C端含有HA-Tag的蛋白质 单柱蛋白纯化 无需蛋白酶 用于蛋白质的连接和特殊标记 用于抗体的分析纯化 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）的特点： 具有调节型强启动子pAOX1，紧密调控编码乙醇氧化酶基因，在以甲醇为唯一碳源的情况下，细胞内总蛋白中乙醇氧化酶能达到30%，缺乏甲醇的情况下，AOX1基因完全关闭 不产生乙醇，可以高密度培养产生大量蛋白 通常也分泌少量蛋白，可以简化分泌型蛋白的纯化 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统的表达载体 整合型表达：单交换（AOX） 整合型表达单交换（HIS） 整合型表达：双交换（AOX） 整合型表达：多拷贝（体内） 体外构建多拷贝目的基因的表达载体 Bgl II A GATC T T CTAG A BamH I G GATC C C CTAG G Formation of N-glycans N-glycosylate Asn in Asn-X-Thr（Ser）sequence，X is any amino acids but Pro. Glyco-engineering steps required for sialic acid transfer in the yeast Golgi. GNE: UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase/N-acetylmannosamine kinase SPS： N-acetylneuraminate-9-hosphate synthase SPP： sialylate-9-P phosphatase CSS： CMP-sialic acid synthase CST： CMP-sialic acid transporter ST： sialyltransferase PCR引物的设计： 正向引物含有一个Xho I位点和Kex蛋白酶切割位点，随后紧接目的基因的第一个密码子。 反向引物包含有Bgl Ⅱ的识别序列和Stop Code。 K: Lys 赖氨酸，R: Arg 精氨酸 如果目的基因中含有Xho I酶切位点，那么就需要利用载体中的其它位点将该基因与α-MF融合在同一阅读框中。这一克隆方案会在目的蛋白质的N端加入载体编码的氨基酸。选用载体中的多克隆位点Bgl II和Kpn I为例。 K: Lys 赖氨酸，R: Arg 精氨酸 乳糖(lac)操纵元的表达调控是利用阻遏蛋白的负性调控而实现的： ? 大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，1ac操纵元处于阻遏状态。i基因在自身的启动子pi控制下，产生阻遏蛋白R。R以四聚体形式与操纵子o结合，阻碍RNA聚合酶与启动子P的结合，阻止基因的转录起始。 R的阻遏作用不是绝对的，R与O偶尔解离，使细胞中还有极低水平的β-半乳糖苷酶及通透酶的生成（本底表达）。 异丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiog-alactoside IPTG），一种化学合成的乳糖类似物，能与阻遏蛋白特异性结合使阻遏蛋白R构象变化，诱导lac操纵元的开放，但本身不受β-半乳糖苷酶的催化分解而十分稳定。 CAP(cAMP activated protein)的正调控 ? cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解供给能量时，cAMP生成少，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就升高，cAMP与cAMP的受体蛋白 CRP （cAMP receptor protein）结合变为CAP，并以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。 在缺乏葡萄糖的培养基中时，CAP合成量增加，CAP具有激活乳糖（Lac）等启动子的功能。一些依赖于CRP的启动子缺乏一般启动子所具有的典型的序列特征。因此RNA聚合酶难以与其结合。CAP能提高RNA聚合酶与启动子结合常数： CAP通过改变启动子的构象以及与酶的相互作用帮助酶分子正确定向,以便DNA结合。 CAP还能抑制RNA聚合酶与DNA中其它位点的结合，从而提高与其特定启动子结合的概率。 由于P1ac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使1ac操纵元转录开放，还不能使细胞很好利用乳糖，必须同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。1ac操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在，又需要没有葡萄糖可供利用，通过CAP的正调控作用，细菌才能充分利用乳糖。 由于P1ac是弱启动子，实际上的基因工程应用中，通过1ac启动子-10区核苷酸突变产生的1acU