蛋白质的裂解解答.pptVIP

第五章蛋白质的裂解 用Edman降解法测多肽链的氨基酸顺序，一次只能连续降解数十个残基，用手工方法最多测二十多个残基。然而，自然界蛋白质的分子量通常在一万以上，因此在测多肽链顺序时，需将它们先裂解成一系列小肽，分别测出它们的顺序，然后再找出它们的接头位置，才能定出该肽链的顺序。所以如何选择肽链裂解的切点，将对顺序测定起着重要作用 裂解条件要求： 裂解点少 专一性强 反应产率高 裂解方法： 酶法 化学法 酶解和化学裂解是顺序分析中互为补充缺一不可的手段 三、蛋白质的化学裂解 是蛋白质顺序测定中的另一重要手段 产物的肽段一般都比较大 裂解产物适合于在自动顺序仪中测定顺序 产物有利于肽段的吻合 因此化学法对较大分子量的蛋白质顺序测定是重要的 CNBr裂解蛋氨酸残基的反应机理： CNBr 裂解肽链的甲硫氨酸羧基所形成肽链的反应 在酸性条件下氨基质子化，可以避免一些副反应 如：用70％甲酸可以破坏肽链的卷曲，使甲硫氨酸侧链暴露，有利于CNBr的裂解 甲硫氨酸的氧化产物亚砜Met(SO) 或砜Met(SO3)不能与CNBr反应 为防止甲硫氨酸被氧化，整个反应应在氮气流或充氮容器中进行 当甲硫氨酸在N末端，则产生游离的高丝氨酸内酯： 当肽链中有二个相邻的甲硫氨酸，则产生一游离高丝氨酸内酯和二个新肽段： 当甲硫氨酸在C末端，则C末端变为高丝氨酸内酯： 2. 实验方法 蛋白质 70%甲酸中 （5-50mg蛋白／ml 70％甲酸） 加30 -100倍过量 CNBr 通N2充分混合后 室温（20℃）黑暗处放置24h 加10倍量双蒸水稀释 冰冻干燥 或用70％三氟 醋酸代替甲酸， 25℃反应12h， 然后用双蒸水 稀释到5%三氟 醋酸以终止反 应 分离纯化 注意，如样品溶解度差，可 3． 讨论 当甲硫氨酸在N末端时，反应常不完全，约有10％Met键保留下来，不被裂解，其原因是由于O-乙酰基取代了N一乙酰基。 （二）羟胺裂解 1．原理 NH2OH 能专一地裂解 –Asn-Gly-之间的肽键，其反应机理是：通过NH2OH作用先形成一个琥珀酸亚胺环状物，最后导致–Asn-Gly-键的裂解，反应式如下： CONH2 CH2 OH- - HN-CH-CO-NH-CH2-CO- 例如：用NH2OH裂解DNA依赖的RNA聚合酶的 ? -亚基， 裂解后用Sephadex G－100柱分离得到二个肽段， 一段是N端肽1 – 208 残基， 另一段是C端肽209 - 329残基。 如没有这一步裂解，中间这段顺序将很难测定 2．实验方法 蛋白质 (1-5mg/ml) 2 mol/l羟胺溶液（含6 mol/l胍 ），45℃保温 LiOH 4.5mol/l调节pH 到9.0 放置4-5h 9％甲酸将pH调至2-3以终止反应。 用Sephadex G-25 或Bia - Gel P-2脱盐 在Sephadex G-75柱上纯化。 3． 讨论 发现，当在pH2.5用NH2○H裂解Asp-Pro键时产率能达到80％。根