常见分子生物学实验方法课题.ppt

Company Logo 目得蛋白高背景 可能原因及处理方法 非特异蛋白结合：在无血清培养液中裂解细胞；在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子预洗，免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂） 裂解液严谨度太低：改用高严谨度裂解液 实验仪器或液体被污染：使用洁净的仪器或液体 转移膜上的非特异吸附：戴手套， 用镊子夹取， 不要接触膜转移面 Company Logo 试剂 RIPA Buffer 蛋白酶抑制剂（aprotinin、leupeptin、pepstatin）、PMSF。 洗涤缓冲液PBS Protein A agarose琼脂糖 抗体 Company Logo 仪器、耗材 摇床、EP管、低温离心机、1.5mlEP管、制冰机、移液器、吸头、水浴锅、细胞刮子（乙醇洗干净风干） Company Logo Staking gel Separating gel Company Logo 转膜 戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致 以适量的转移Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜15－30min，如果是PVDF膜，必须先用甲醇激活后浸泡。 方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极 排去滤纸、胶和膜间的气泡。 电转时间：100V 1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活 选择 转移结束后，凝胶用考马氏亮兰染色以确定转移效率 膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置 Company Logo 湿转系统 Company Logo 半干转移系统 Company Logo 封闭 用5％脱脂奶粉或3％BSA （含0.1％Tween20 TBS或PBS配制） 时间：室温2h或4oC过夜 Company Logo 一抗、二抗孵育 把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。 Company Logo 显色 辣根过氧化物酶：底物为DAB 碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT 化学发光显影 最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品） 注意：化学发光前将膜用不含Tween20的TBS或PBS洗涤一次 曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定 二抗与底物反应显色 Company Logo 流程图 Company Logo Western Blot常见问题分析 Company Logo SDS电泳 胶不平？ 凝胶漏液？ 胶板洗刷干净 加入AP和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐 Company Logo 条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？ 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适 SDS电泳 Company Logo 转膜及抗体检测 凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸 确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温 Company Logo 转移到膜上的蛋白很少 蛋白分子量 10KD 蛋白的等电点 9 SDS浓度不合适 凝胶太厚 原因 对 策 蛋白分子量10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜 更换高pH值Buffer 在阴极buffer中加入0.005 - 0.01% SDS 可提高转膜效率 延长转膜时间 Company Logo 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉反应 抗体浓度过高 原因 对 策 转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应 杂交前检测一抗、二抗的工作浓度 背景太高 Company Logo 杂交信号很弱 抗体保存不当 抗原不充足 膜的漂洗过度 原因 对 策 抗体长期保存应在－70℃，使用前做效价检测 增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照 减少漂洗的时间和次数 Company Logo 一抗不是唯一特异的 二抗出现非特异结合 原