脉冲场凝胶电泳技术-副本精讲.ppt

脉冲场凝胶电泳技术 生科院生物学 卜俊燕 201571451 脉冲场凝胶电泳 (Pulsed field gelelectrophoresis,PFGE), 是近年发展起来的一种重要的分离大分子量线性DNA分子的电泳技术。 普通的琼脂糖凝胶电泳分离DNA分子的上限 是50 kb 大于该极限的DNA分子,常规的琼脂糖凝胶便失去了其分子筛的作用,导致电泳带型无法 分辨，PFGE的发明正好解决了这一问题。 1984年, Schwartz和Cantor首次用此技术成功分离得到酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)细胞的16条完整染色体DNA。 此后,随着PFGE技术的不断改进,现已具有分辨出高达10Mb级DNA的能力。 这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生物基因组结构的研究。 PFGE的应用 PFGE具有独特的分离大片段DNA的能力,是一种分析染色体DNA强有力的工具。目前,PFGE主要应用于染色体DNA的分离、微生物基因分型、DNA辐射损伤修复、细胞凋亡、酵母人工染色体电泳分析及单向电场泳难以分辨的DNA图谱制作等研究中。现简述以下几个方面。 1　PFGE在分子分型方面的应用　 通过微生物分型可以鉴定菌株是否一致、比较它们的亲缘关系,对于细菌性传染病的监测、传染源追踪、传播途径的调查和识别有着非常重要的意义。 近年来随着分子生物学技术的发展,基因分型技术日渐受到青睐。现代的分子分型技术主要有:①基于限制性内切酶的分型技术:PFGE分型和RFLP分型;②基于PCR的分型技术: RAPD分型、Rep-PCR分型、AFLP分型;③基于核苷酸序列分析的分型技术:SLST分型和MLST分型。 Tenover等提出了有关PFGE图谱与测定菌株相关性的判别标准,根据电泳条带可分为:如PFGE图谱一致,说明为相同菌株;有1~3条带的差异说明菌株间有相近关系,且只有单基因的改变;4~6条带的差异说明菌株间可能有相近关系,表示出有2个独立基因的差异;如菌株间有6条或更多条带差异,说明有3个或更多的基因差异,视为无相关性。 PFGE的基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变的脉冲电场, 其方向、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改 变时,大分子DNA便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重 新定向后,才能继续向前泳动,DNA分子越大,这种重新定向 需要的时间就越长,当DNA分子改变方向的时间小于脉冲 时间时,DNA就可以按照其分子量大小分开,经EB染色后 在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。 PFGE的原理 PFGE的方法 常规的DNA制备方法得不到完整的大分子量DNA,因为DNA大片段很脆弱,容易因提取过程中的机械作用如吸打、离心等而导致DNA的断裂。 为了得到完整的大量DNA大片段,目前主要是采用低熔点琼脂糖(Lowmelting point agarose)包埋样品,再进行原位裂解和去蛋白处理从而释放DNA 低熔点琼脂糖在这个过程中阻止了机械力对DNA大片段的剪切作用,因而细胞裂解所释放的DNA大片段包埋在胶栓中。制作好的样品插块可以在电泳时直接插入加样孔中 PFGE的简要操作步骤包括样品的包埋、原位裂解、稀少酶切位点的限制性内切酶对染色体DNA的消化、脉冲场电泳、凝胶的EB染色观察5个步骤。 PFGE的操作步骤 胶块的制备 1、??在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，分别加入约2ml细胞悬浊液（CSB）；2、??在1.5ml eppendorf管上标记好对应样品的名称；3、??在模具上标记好对应样品的名称；? 4、??用CSB湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB中，用bioMerieux Vitek colorimeter测其OD值，并调整至3.6~4.5。如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果OD值小于3.6，增加菌量提高其浓度。5、??取400μl细菌悬浊液于相应的1.5ml eppendorf管中，置于37℃水浴中孵育5分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中。 6、??从水浴箱中取出eppendorf管，每管加入20μl蛋白酶K（储存液浓度为20mg/ml）混匀，使其终浓度为0.5mg/ml。7、??制备好1%Seakem Gold：1%SDS，放于56℃水浴箱中。8、??在eppendorf管中加入400μl的1% Seakem Gold：1%SDS，用枪头轻轻混匀。9、??将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。 注意事项：（1）??用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。（2）??细胞悬浊液、蛋白酶K要置于冰上。（3）??在混合细胞悬