免疫磁珠分离技术及其应用精讲.ppt

前言 免疫磁珠分离技术介绍 免疫磁分离技术的应用 一、前言 免疫磁珠分离技术(Immunomagnetic beads sep—aration techniques，IMB) 是将免疫学反应的高度特异性与磁珠特有的磁响应性相结合的一种新的免疫学技术；是一种特异性强、灵质纯化敏度高的免疫学检测方法和抗原纯化手段。是近年来国内外研究较多的一种新的免疫学技术。 目前该项技术在细胞分离、蛋白、免疫学及微生物学检测等方面均取得了较大的进展，是目前最有推广价值的技术之一。 二、免疫磁珠分离技术 1、免疫磁珠分离技术原理 利用人工合成的内含铁成分，可被磁铁磁力所吸引，外有功能基团，可结合活性蛋白质(抗体)的磁珠，作为抗体的载体。当磁珠上的抗体与相应的微生物或特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，这种复合物具有较高的磁响应性，在磁铁磁力的作用下定向移动，使复合物与其他物质分离，而达到分离、浓缩、纯化微生物或特异性抗原物质的目的。 2、免疫磁珠法分类 ⑴、阳性分离法 磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞 ⑵、阴性分离法 磁珠结合不需要的细胞，游离于磁场的细胞为所需细胞 一般而言，阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大，阳性分离法用的更多。 3、磁性微珠(magnetic beads): 磁性微珠是以金属离子为核心，外层均匀包裹高分子聚合体的固相颗粒。 磁性微珠上既可标记针对某种细胞表面抗原的特异性抗体（直接法）; 也可标记羊抗鼠IgG抗体(间接法），使分离细胞的范围大大扩大 4 、免疫磁性微球的制备 5、该技术的主要优点 ⑴、细小而均一的微球为配基与受体的反应提供了较大的接触面积 ⑵、磁珠的磁性使其可以用磁力收集器方便快速地获得分离，且对被分离物无损伤 ⑶、检测复杂的生物样本和食品样本等时受到颗粒性杂质等的影响较小 ⑷、作为一种流动性的固相支持物，其洗涤和反应都进行得更加充分 三、免疫磁性微球的应用 斑点免疫层析、免疫磁分离技术在E．coli 0157：H7检测中的应用 1、 E．coli 0157：H7 是大肠杆菌的其中一个类型，该种病菌常见于牛羊等温血动物的肠内。这一型的大肠杆菌会释放一种强烈的毒素，并可能导致肠管出现严重症状。已被世界卫生组织确定为新发现的28种传染病病原体之一,成为各国食品安全和公共卫生监控的重点。 ⑴病征：患者可能出现各种症状，包括严重的腹泻、带血腹泻、发烧、腹绞痛及呕吐。情况严重时，更可能并发急性肾病。5岁以下的儿童出现该等并发症的风险较高。若治疗不当，可能会致命。 ⑵传播途径： 该种疾病可通过饮用受污染的水或进食未熟透的食物(特别是免治牛肉、汉堡扒及烤牛肉)而感染。饮用或进食未经消毒的奶类、芝士、蔬菜、果汁及乳酪而染病的个案亦有发现。此外，若个人卫生欠佳，亦可能会通过人传人的途径，或经进食受粪便污染的食物而感染该种病菌。 ⑶潜伏期： 通常为3至4日，但亦会长达9日。 ⑷治理方法： 感染大肠杆菌O157 :H7的临床治理方法主要属支持性治疗。若患者出现腹泻，补充失去的水份及电解质十分重要。约50%有肾并发症的患者在出现急性症状时需要特别治疗或输血。 2、斑点免疫层析法（DICA) 又称免疫胶体金标记法．是利用免疫色层技术来检测样品中E.Coli O157在E．Coli检测卡上，将胶体金标记的兔抗O157，抗体和兔抗羊IgG抗体分别固定在膜上下，做为测试带和质控带。样品增菌液滴加到加样孔膜上并展开．若含有E.Coli O157就会结合到检测带处形成抗原—抗体复合物而星现可见的红色带，而羊IgG结台到质控带星现红色，它具有简便、快速定性作用。 3、检验方法 ⑴mEC增菌培养 取样品5g接种到50ml 10％新生霉索mEC增菌液中 摇匀放恒温摇床，37℃振荡培养6h。 ⑵DICA法 用试剂盒所配专用棉拭子，沾取样品增菌液后，插入EHE．Coli检测卡一端的加样孔中，10min内读取结果；只有质控带出现红色条带表明无E．Coli O157抗原存在．同时也表示实验正确；出现两条红色条带(测试和质控带)表示可能有E．Coli O157抗原存在,如均无出现红色条带，表示实验失败。 ⑶IMS法 将样品增菌液分成DICA法阳性和阴性两组．均取1ml加入1.5ml ep离心管中(离心管事先已加入20μl免疫磁珠)振摇20～30min，上磁铁板吸附沉淀免疫磁珠，吸去上清液，反复用PBT-T洗涤2次，加50μl PBs-T重悬浮、混匀，分涂于2块CT-SMAC平板37℃培养18～20h，挑取中等大小不发酵山梨醇的无色半透明可疑菌落和发酵山梨醇的红色菌落(防止发酵山梨醇的E.Coil O157，H