生化实验技术与方法汇总.pptVIP

PAL总活力、比活力、蛋白质含量的计算 步骤 体积（ml） 蛋白质含量 （mg） 总活力（m） 比活力 （m/mg protein） 粗提 硫酸铵沉淀 透析 离子交换层析 糖的薄层层析 实验目的 学习和掌握薄层层析的原理和方法 实验原理 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。 固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。 按操作形式不同分类： 柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。 纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。 薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。 层析法的分类 按机理分类： 吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶层析 亲和层析 薄层层析是一种微量而快速的层析方法。该法是把吸附剂或支持剂涂布在玻璃板上成为一薄层，将要分析的样品滴加到薄层上，然后用合适的溶剂进行展开，使样品各个成分分离，然后进行定性鉴定和定量测定。 实验操作 硅胶薄板的制备：注意胶要均匀。 1.2 g硅胶H加4.0 ml0.5%CMC溶液，研磨数分钟后，倒在预先准备好的玻璃板上，铺开，使浆液分部均匀，放在水平台上，自然晾干。 硅胶G 硅胶H 硅胶GF254 硅胶HF254 2. 板的处理： 薄板的活化：105℃，0.5h 薄板的刮分：径向层析的优点是：样品展层后图谱呈弧形带状，使Rf值相近的化合物也能清楚地分开。 3. 点样：样品为鼠李糖、木糖和葡萄糖。点样量8-10μl。注意：点样点的直径小于5mm，点样要少量多次，吹风机风力不能过大。 4. 展层：展层溶剂为：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=12：3：3：2（体积比），新鲜配制。 5. 显色：显色剂：苯胺-二苯胺-磷酸试剂。 20mm 10mm 30mm 8mm 苯丙氨酸解氨酶的提取纯化 实验目的 掌握分离纯化酶的基本操作和方法。 实验原理 苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine：ammonia lyase，简称PAL；EC4.3.1.5）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用。 本次实验是以银杏叶为原料采用分步盐析、透析脱盐、离子交换等方法得到苯丙氨酸解氨酶。 离子交换层析法主要是利用溶液中各种带电离子与离子交换剂之间的结合力的差异进行的分离方法。各种氨基酸分子的等电点不同，在同一pH时所带电荷不同，与离子交换树脂的结合力有差异，因此可依据结合力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下来，达到分离的效果。 离子交换剂为固定相。 带电离子与离子交换剂之间的作用力主要是静电力，它们的结合是可逆的。 离子交换剂由基质（惰性不溶性载体）、电荷基团（功能基团）和反离子（平衡离子）三部分组成。 纤维素-O-CH2-COO--Na+ 基质 电荷基团 反离子 离子交换剂的种类 （一）按载体种类不同 1.离子交换树脂：主要有聚苯乙烯树脂 2.离子交换纤维素 3.离子交换凝胶 （二）按功能基团带电荷性质不同 阳离子交换剂—功能基团带负电荷 （平衡离子带正电荷） ，与阳离子交换。 阴离子交换剂 —功能基团带正电荷（平衡离子带负电荷） ，与阴离子交换。 　　　　聚苯乙烯-苯二乙烯是由苯乙烯（单体）和苯二乙烯（交联剂）进行聚合和交联反应生成的具有网状结构的高聚物。它是离子交换树脂的基质，带电基团是通过后来的反应引入基质的，树脂一般都制成球形颗粒。 —CH2—CH2—CH—CH2—CH2—CH— SO3— —CH —CH2—CH2—CH— 苯环—SO3— 有氢型和钠型 H+或Na+ H+或Na+ 从交换剂上洗脱目的物的方法有两种： 1.调节洗脱液的pH，使目的物在此pH下失去电荷甚至带相反电荷。 2.用高浓度的同性离子，将目的离子取代下来。 仪器 高速冷冻离心机