基因功能方法讲述.ppt

(3)将胚胎干细胞受体细胞注入小鼠的囊胚，将这些囊胚导入假孕母鼠子宫中，产生的雄性嵌合鼠子代与正常的雌鼠交配即可获得生殖系统携带该基因的纯合鼠，进而分析被剔除基因的功能。 4.2 基因敲入 基因敲除技术已经成为研究基因功能的强有力手段，但对于许多基因来说，简单的失活常导致令人费解的无改变的表型。最常见的解释是某些其它基因取代了靶基因的功能，但要在普通基因敲除小鼠中证明这一点十分困难。基因敲入即通过基因打靶用一种基因替换另一种基因以确定它们是否具有相同功能。 基因敲入的设计，是一个类似于普通基因敲除法的一步同源重组过程。不同之处在于，设计打靶载体时需将靶基因第一个外显子的N-端序列缺失，并将新的替换基因置于靶基因的调控序列之下，使其能精确地按照靶基因的调控模式表达。 此方法不仅能用一种基因置换另一种基因，且可以系统地改变基因的结构，分析其蛋白产物各功能区的作用。 5.人工染色体的转导 转基因技术是进行蛋白功能分析和基因表达调控的有力手段,但使用小的质粒重组体存在表达水平低、缺乏组织特异性等缺点,若将大的DNA片段克隆入酵母人工染色体(YACs)或细菌染色体，可产生较好的表达水平和组织特异性,并可精确地调节同源重组。 酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)： 是一类酵母穿梭载体，具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因；还具有酵母菌染色体的一些特点。可以接受100-1000kb的外源DNA片段。 原理：酵母人工染色体就是把酵母染色体上与基因复制和表达有关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使酵母的转录功能和复制功能。 酵母人工染色体DNA转导的方法： 主要有核注射、脂质体介导和酵母原生质体融合等。 优点： 可使导入基因的水平与内源基因相当,并且具有类似于天然的剪接机理,适用于复杂的基因功能分析。 YAC要具备的主要功能成份 1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。 2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。 3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。 构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件 与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。 6.基因诱捕技术 基因诱捕是通过物理、化学、生物等方法将一个带有外源基因如抗药基因或报告基因的DNA载体导入到ES细胞中。外源基因通过捕获到的内源基因表达调控元件获得表达的同时，使内源的基因功能丧失。通过显微注射或ES细胞融合技术可以获得特定基因缺失的动物，用于功能研究. 7. 基因编码产物相互作用蛋白的研究 细胞各种基本功能的完成离不开蛋白质之间的相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白质复合物。因此，确定能够与新基因编码的蛋白质表达终产物相互作用的上下游蛋白质分子，也是研究新基因功能的一个十分重要的方面。 目前常用的研究蛋白质相互作用的技术包括传统的基于亲和分析而建立的免疫共沉淀技术和近年来建立和广泛应用的酵母双杂交系统等。 免疫共沉淀技术 免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。 原理： 利用标签抗体与融合蛋白携带的标签之间的高亲和力特性纯化和检出溶液中的靶分子。 该方法的优点是： 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰，所处环境条件接近天然状态的，能够反映体内相互作用情况，也可分离到天然状态的相互作用蛋白复合物，但应注意，有时免疫共沉淀的蛋白质并非是直接相互作用，而是间接的相互作用，其灵敏度也相对较低。 酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是一种基于转录重建而建立的研究生物大分子相互作用的简便而有效的研究方法。 双杂交技术的基础是在一些转录因子中发现的DNA结合结构与和转录激活结构域，一个转录激活结构域联合一个DNA结合结构域有可能在TATA框位置启动RNA聚合酶Ⅱ复合体的装配，引发转录过程。 结构域：蛋白质的三级结构中存在的一些在结构和功能上相对独立的部位，如球形或纤维状结构，他们介于二级结构和三级结构之间。 激活结构域:指转录因子中与转录起始复合体接触与互作的结构部位。 优势： 它可用已经克隆的基因从特定细胞的cDNA表达文库中“钓取”与其编码产物相互作用的蛋白质及相应基因序列，它检测的相互作用在体内发生，无需额外的纯化步骤。 酵母双杂交系统的局限性： 双杂交体系是在细胞核内分析蛋白质之间相互作用的一种方法，而许多蛋白质之间的相互作用依赖于翻译后的修饰和加工过程，如糖基化和二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。 有些蛋白质的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的帮助，这在一定程度上也会限制使用双杂交体系对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白进行研究。 结语 新基因功能研究并没有一个完全固定不变的模式，这里讲的的内