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免疫组化ABC法 一、切片和脱蜡 切5-10微米的薄片，贴于载玻片上，脱蜡后进行后续反应。步骤如下： （1）二甲苯脱蜡 （2）梯度酒精水化（无水酒精、95%酒精、90%酒精、85%酒精、80%酒精） 二、微波修复抗原 三、ABC法 ⑴含1% Triton X-100和0.03 %H2O2的0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS, pH7.4)室温15min； ⑵含3%牛血清白蛋白(BSA, Sigma)和1%正常羊血清(NGS, Vector)的0.01 mol/L PBS室温30min； ⑶一抗室温孵育过夜。抗体用含3%牛血清白蛋白(BSA，Sigma)和1%NGS的0.01 mol/L PBS稀释(下同)； ⑷0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min; ⑸生物素化二抗室温孵育2h; ⑹0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min;⑺ABC(1:100, Vector) 室温2h; ⑻0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min;⑼含0.03%DAB和0.006% H2O2的Tris盐酸缓冲液(TB, pH7.6)室温10~15 min。 （10）0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min; （11）贴片，甘油封片 四、观察结果并分析 * * 组织抗原 第一抗体 第二抗体 HRP 生物素 亲和素 原理：酶标记Biotin形成酶素化 Biotin 一 ABC法 酶素化Biotin＋Avidin--- ABC复合物 抗原---特异抗体--- Biotin标记二抗--- Avidin ● Biotin ● HRP 实验原理 步骤：三步法 优点：敏感性较高 特异性强 应用范围广 缺点：某些脏器存在内源性生物素干扰 Avidin与糖基、纤维组织、核酸及细胞膜中 磷脂有非特异反应 实验步骤 免疫组化ABC法 实验步骤 免疫组化ABC法 实验步骤 免疫组化ABC法 实验步骤 免疫组化ABC法 实验步骤 免疫组化ABC法