总RNA的分离纯化及逆转录实验.pptVIP

人外周血单个核细胞总RNA的分离纯化及其逆转录 外周血单个核细胞分离原理 实验步骤 人外周血单个核细胞的分离： 1.吸取2ml淋巴细胞分离液加入玻璃试管； 2.取抗凝血1ml，用1ml生理盐水稀释混匀，然后沿管壁缓慢加入淋巴分离液（上层为抗凝血，下层为淋巴细胞分离液）； 3. 2500rpm，离心15min(沉降系数不同，而分离出单核细胞)； 4. 吸取出最上层血浆（弃用），再吸取单核细胞层至一新的试管中，加生理盐水至管口1cm处，混匀后离心，2500rpm,5min； 5.去上清（弃用），加生理盐水0.5ml 吹打混匀后，转入1.5mlEP管中，2500rpm,5min； 6.去上清（弃用），留细胞沉淀于Ep管中于下一步总RNA的提取。 RNA提取原理 真核生物，绝大多数基因含有内含子，因此不易直接由基因组克隆目的基因，提取RNA并逆转录形成cDNA是获得真核生物基因的主要手段 RNA极易降解，因其RNA酶分布广、活性强、且难以失活，痕量的RNA酶就能够造成严重的RNA降解，实验中采用多种措施抑制RNA酶的活性，减少RNA的降解。 酸性酚法抽提RNA 其原理是，苯酚在酸性条件下既可溶解DNA，又是蛋白变性剂，联用氯仿可使细胞裂解以及蛋白质与RNA分离，最后利用异丙醇沉淀核酸，获的纯化的总RNA。 抑制RNA酶活性的试剂 　 　1.