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流式荧光免疫技术 主要内容 流式细胞仪的基本结构及其作用 工作原理 流式荧光免疫分析的技术要点 流式荧光免疫分析技术的应用 流式荧光免疫技术 什么是 FCM ？ 流式细胞术：利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析及分选的技术 激光技术+流体力学+光电测量技术+计算机技术+细胞荧光化学技术+单克隆抗体技术 流式细胞仪的结构 液流系统——流动室及液流驱动系统（鞘流原理） 光路系统： 1、激光光源及光束成形系统： 氩离子(488nm) 2、反光镜、光束形成器、透镜组、滤光片、小孔 3.信号检测与分析：光电倍增管(PMT)、补偿电路 数据处理系统：存储、显示、分析系统（计算机） 流式细胞技术原理 一.基本工作原理：将经荧光抗体或染色剂染色后的单个细胞悬液和鞘液分别经硅化管道进入流动室，形成鞘液包裹细胞悬液的稳态层流，使细胞不变的以稳定的层流形式通过喷嘴高速射下，与垂直向激光交汇。细胞大小和内部颗粒多寡不同而对激光产生不同散射。 散射光的测定 激光束上的低角度散射光被称为前向散射光(FS)，主要反映细胞的大小；与激光束成90度角收集的散射光信号称侧向散射光(SS)，主要反映细胞的颗粒特性。 荧光 细胞亦可发出荧光(FL) *最常用于单克隆抗体标记的三种荧光染料 FITC PE 藻红蛋白-得州红 散射光信号 1.分选的基本原理 流式细胞计的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是：由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。 2.分选技术要求 分选速度---与细胞含量相关（一般5000个/秒）细胞特性 分选纯度---仪器精密度、实验设计的选择、被选细胞的生物学特性等 分选收获率---与纯度相对应 纯度高则收获率相对低，反之，则高 分选得率---与分选速度相关，速度越快则得率下降，反之，则高 流式荧光免疫分析的技术要点 免疫检测样品的制备 细胞悬液的保存 荧光染色 细胞自发荧光 质量控制 外周血淋巴细胞样品的制备 常用淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞 培养细胞的样品制备 悬浮生长—直接吹打 贴壁生长—蛋白消化酶+机械敲打+400目尼龙网过滤 新鲜组织细胞悬液的制备 机械法—剪碎法、网搓、研磨 酶处理法 –胰蛋白酶、胶原酶、胃蛋白酶 化学试剂处理法—EDTA 表面活性剂—破坏膜结构 深低温保存法 至少保存一年 乙醇或甲醇保存法 将悬浊液缓慢加入70%冷乙醇或75%冷甲醇， 边加边振荡，4度保存，不超过两周 甲醛或多聚甲醛固定法 常用0.37%--1.5%的甲醛缓冲液或多聚甲醛缓冲液 固定 ，保存两个月 常用荧光染料 条件：有较高的量子产额和消光系数；对488nm的激发光有较强的吸收；发射荧光波长与激发光波长之间有较大的差；容易与单克隆抗体结合而不影响抗体活性。 荧光免疫标记 荧光强度与光量子产额之间的关系 F=Q(I－eεCL) （1）与细胞成分的结合方式—结构亲和、嵌入结合、共价键结合、特异性结合 （2）标记方法 直接免疫荧光染色、间接免疫荧光染色、双参数或多参数分析师荧光抗体的组合标记 常用的单克隆抗体荧光标记探针 488nm激光激发： FITC（异硫氰酸荧光素）： 荧光强度可受pH的影响，当pH降低时其荧光强度也随之减弱 PE（藻红蛋白） PerCP（多甲藻叶绿素蛋白）：光量子产量并不太高，最好应用在检测表达较高的抗原上 PerCP-Cy5.5（叶绿素蛋白偶联物） PE-Cy7（藻红蛋白偶联物） PE-Cy5（藻红蛋白偶联物，又称Cy-Chrome） PE-Texas Red（藻红蛋白-德州红偶联物，又称ECD） 633nm激光激发： APC（别藻青蛋白） APC-Cy7（别藻青蛋白偶联物） 常用荧光染料组合 FITC＋PE：最常用的双色组合 FITC＋PE＋PerCP：最常用的三色组合，进行多色荧光染色时荧光光谱重叠补偿很小，但PerCP光量子产量并不太高，最好应用在检测表达较高的抗原上，如CD4/8/3 FITC＋PE＋PerCP+APC：最常用的四色组合，一