2013级生-PCR分析.ppt

DNA， 生命的蓝图 Mullis的第一个PCR实验 1983年9月中旬。 Mullis在反应体系中加 入DNA聚合酶后在37 ℃一直保温。结果第二 天在琼脂糖电泳上没有 看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR反应体系 1、 10×PCR buffer 10μl 2、dNTP mix 各200μmol/L 3、引物1 1μmol/L 4、引物2 1μmol/L 5、DNA模板 50ng-1μg 6、Taq 酶 2U 7、 加双蒸水至总体积为100μl PCR扩增产物的电泳分析 琼脂糖凝胶电泳 常用于临床检测（定性） 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离效果比琼脂糖好，条带比较集中 可用于科研及检测分析 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物 根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖 低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等 电泳缓冲液 常用三种缓冲液 Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE） TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀 TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解 核酸电泳的指示剂 指示剂： 溴酚兰 二甲苯青 溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色 电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段 核酸电泳的指示剂 二甲苯青：水溶液呈兰色， 电泳时，其迁移速率与双链线性DNA大致相当 载样缓冲液 指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液 作用： ①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内 ②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置 ③使样品呈色，使加样操作更方便 核酸电泳的染色剂 溴化乙锭（ethidium bromide，EB） 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光 可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng 溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察 核酸电泳的染色剂 银染色：银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色 主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色 灵敏度比EB高200倍，但银染色后，DNA不宜回收 聚丙烯酰胺凝胶电泳 适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析