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ABI 7500 fast 荧光定量 PCR仪的应用及操作 基础医学研究中心 2011.04 实时荧光定量PCR的原理 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。 Ct值 CT值定义：扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。 CT值必须位于指数增长阶段内。 DNA产物的荧光标记 1. 非特异性荧光标记–SYBR Green I染料法 SYBR Green I与DNA双链的小沟结合后发光，游离时不发光。 变性时，DNA双链分开，无荧光；在延伸结束阶段采集荧光信号。 SYBR Green也能和非特异的双链DNA结合发光，所以必须在反应结束时做熔解曲线分析，确定扩增结果是否可靠。 熔解曲线 DNA产物的荧光标记 特异性荧光标记 –TaqMan探针法 实时荧光定量PCR的应用 起点定量 绝对定量(Absolute Quantification) 相对定量(Relative Quantification) 终点定性 等位基因分型(Allelic Discrimination) 阴阳性鉴定(Plus/Minus with IPC) 定量实验 定量实验-绝对定量 目的是确定样本中目标基因的准确拷贝数 定量实验-绝对定量 标准样品中拷贝数的计算方法 拷贝数（摩尔分子数）=摩尔数×6.02 × 1023 摩尔数=质量（g）/ 分子量（daltons） 质量—通过分光光度计计算 平均分子量：dsDNA=碱基数×660 dalton/碱基 例如 长3000bp，浓度为100ng/ul 的dsDNA 3000bp dsDNA的分子量=3000 × 660，即1.98*106 daltons 摩尔数/ul= 100 × 10-9g/ 1.98 × 106 daltons，即5.05 ×10-14 所以，拷贝数= 5.05 ×10-14 × 6.02 × 1023 =3 ×1010个拷贝 定量试验-相对定量 △Ct实验组 = Ct目的基因 - Ct内参基因 △Ct对照组 = Ct目的基因 - Ct内参基因 △ △ Ct = △Ct实验组 - △Ct对照组 基因表达差异= 2 -△△Ct Ct值 Ct值在18-32之间是比较准确的，如果超出这个范围，建议调整初始模板浓度。 模板浓度如果降低1倍，则Ct值相应增加1个循环。 用1ugRNA逆转录出的cDNA为模板：扩增内参基因时可将模板稀释100倍左右；扩增目的基因按梯度稀释，找到最佳的稀释倍数。 建议选择两个内参基因。 定性实验 – 等位基因鉴定实验 定性实验 – 等位基因鉴定实验 注意事项 Reaction tube：0.1ml 架子：96 wells，8-strip 不要在盖子或膜上面做标记 115 网盘-“我的网盘”-7500fast 文件夹 用户名：swtxy1979@ 密码：7500fast 软件操作演示 SYNGENE GBOXiChemiXT 紫外及化学发光成像仪 基础医学研究中心 2011.04 应用 核酸琼脂糖凝胶的成像 Western Blot 化学发光成像—预冷CCD GeneSnap 软件 GeneSnap 软件- 琼脂糖凝胶成像 GeneSnap 软件 GeneSnap 软件 GeneSnap 软件-化学发光成像 GeneSnap 软件 GeneSnap 软件 The End * * 起点定量与终点定量