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温度升高会增加疏水作用，但注意蛋白质等生物大分子在较高温度下会变性。对特定的分离，操作温度需保持恒定，才能确保层析结果具良好的重复性。 * 膜联蛋白 * 3. 离子交换层析 可分为阳离子交换层析与阴离子交换层析。 1、树脂类：分离氨基酸，孔径小； 2、纤维素类：分离蛋白质，孔径大。 3、交联葡聚糖： Sephadex 容量大3-4倍，净电荷 分子筛 ?—?? ?? ? ?—?? Pr? 洗脱方法 增加离子强度 改变pH 洗脱方式 梯度洗脱 阶段洗脱 分段洗脱 一些常用的纤维素离子交换剂Sephadex离子交换剂 离子交换剂 可电离基团 I、阳离子交换剂 CM-纤维素（弱酸型） 羧甲基 P-纤维素（中强酸型） 磷酸基 SE-纤维素（强酸型） 磺乙基 SP-Sephadex(强酸型) 磺丙基 II、阴离子交换剂 AE-纤维素（弱碱型） 氨基乙基 PAB-纤维素（弱碱型） 对氨基苯甲基 DEAE-纤维素（中强碱型） 二乙基氨基乙基 DEAE-Sephadex（中强碱型） 二乙基氨基乙基 TEAE-纤维素（强碱型） 三乙基氨基乙基 QAE-Sephadex（强碱型） 二乙基（2-羟丙基）-氨基乙基 离子交换层析 （五）利用选择性吸附的纯化方法 利用待纯化的分子和杂质分子与吸附试剂之间吸附能力和解吸能力的不同而达到分离目的。硅胶、氧化铝、活性炭等。分离蛋白常用 1. 羟磷灰石层析：用于分离蛋白质或核酸。蛋白质中负电基团与晶体表面的钙离子结合，而带正电集团与磷酸基相互作用。50g蛋白/L柱床体积。 2. 疏水作用层析：根据蛋白质表面的疏水性差别分离。连接在支持介质上的疏水基团与蛋白质表面上暴露的疏水基团结合。 2. 疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC） 概念早在1948年由Tiselius提出，真正发展是1970年开发出一系列适合疏水层析的固定相以后； 疏水层析的原理完全不同于离子交换层析或凝胶过滤层析等技术，使该技术与后两者经常联合使用来分离复杂的生物样品； 目前该技术主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。 1)原理 高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合。 蛋白质等生物大分子与HIC介质的结合不仅取决于分子疏水性表面的比例，还与疏水补丁的分布有关; 一般来说每个分子被吸附的过程都会有1个配基参与，换句话说，分子在介质上发生的结合是多点结合。 疏水层析与反相层析RPC的区别 ： RPC介质上疏水配基的取代程度大大高于HIC介质，RPC更适合在水-有机溶剂体系中具有良好稳定性的肽和小分子蛋白质的分离纯化； HIC过程洗脱条件温和，通常降低洗脱剂的盐浓度就能达到目的，在蛋白质的纯化中有较广泛的应用。 蛋白质种类 TSK Gel Phenyl-5PW疏水柱中的保留时间（min） SynChropak反相柱中 的保留时间（min） 细胞色素c 0.6 12.6 肌红蛋白 0.8 14.6 核糖核酸酶A 1.6 10.7 伴清蛋白 6.3 17.3 卵清蛋白 6.5 18.5 溶菌酶 8.5 14.3 β-葡萄糖苷酶 15.6 5.3 α-胰凝乳蛋白酶 16.6 13.6 α-胰凝乳蛋白酶原 18.1 16.8 乳过氧化物酶 19.5 20.3 牛血清白蛋白 20.5 17.1 铁蛋白 20.8 16.6 12种蛋白质在疏水柱和反相柱中的选择性比较 疏水作用层析过程的参数 固定相类型：包括基质的类型、配基的种类和取代程度 流动相组成：盐的种类和浓度、流动相的pH、以及其他添加剂的影响 层析条件 ：温度、流速等 2）介质（基质+配基） 基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人工合成聚合物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯类。其中，半刚性的琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介质。 近年来研制超大(superporous)琼脂糖，在扩散孔的基础上增加了对流孔，在流速较高的条件下获较好的分辨率。 壳聚糖具有良好的生物相容性和化学稳定性，近年来在疏水层析中也得到了应用。 HIC介质的疏水配基主要为烷基和芳香基，与RPC介质相比，其烷基通常在C8以下，芳香基多为苯基 R代表疏水配基 M代表基质 调节比例可控制介质的配基密度 偶联至基质的常见配基类型 （A）丁基（B）辛基（C）苯基（D）新戊基 对某些蛋白而言，有些配基与其结合力太强，为洗脱有时需用有机溶剂，有变性风