常用免疫测定方法的原理和质量剖析.ppt

常用免疫测定方法的原理及其测定质量问题 汪子伟2012.8.9 非标记免疫分析：补体结合试验 ，免疫速率散射比浊测定 标记免疫分析：放射免疫法 、酶标记免疫法 、荧光免疫法、发光免疫法、电化学发光免疫 定量免疫免疫分析中的质量问题 1、工具抗体 2、包被（反应载体及其抗原或抗体的包被 ） 3、标记物 4、校准 5、基质效应 从定性试验到定量测定 补体结合试验，曾经最敏感 抗原-抗体反应形成的免疫复合物能结合补体，红细胞及其抗体能指示补体的含量，由此较敏感地推断抗原或抗体的含量 主要特点：现已少用，红细胞不易保存和标准化 免疫速率散射比浊测定 即测定最大反应速率，在抗体过量的情况下，反应峰值的高低与抗原的量成正比。峰值（最大导数）出现的时间与抗体的浓度及其亲和力直接相关。利用不同抗原含量与其速率峰值的函数关系，计算出抗原含量 主要特点：不必等到抗原抗体达到平衡，可节省反应时间，检测敏感度量为mg/L水平,生化仪上可做透射比浊测定，抗体必须过量且为R型 标记免疫分析 放射免疫法（同位素碘125标记）：免疫放射测定法 ，放射免疫测定法 酶标记免疫法（标记酶分子量比碘125大，空间位阻大，标记酶容易失活） 荧光免疫法：时间分辨荧光免疫分析 ，酶标记荧光免疫测定 ，荧光偏振免疫测定 ，Luminex技术 发光免疫法 电化学发光免疫 放射免疫法（同位素碘125标记） 免疫放射测定法（immunoradiometric assay， IRMA）：夹心法，系用放射性同位素标记抗体（*Ab） 主要特点：灵敏度较高，被测物需有两个以上抗原决定簇 放射免疫测定法（radioimmunoassay，RIA）：竞争法，系利用放射性同位素标记抗原，主要特点：被测物低浓度时的精度较差，受到抗体量的限制 标记免疫的发展 酶标记免疫法 显色底物法（比如酶联免疫吸附试验，ELISA）：主要采用辣根过氧化物酶标记和碱性磷酸酶标记，主要特点：大多数采用的96孔酶标板，测单孔成本低，新项目上得快，但容积小，孔间包被差异大，特别是偶尔出现的“坏包被孔”导致双孔测定的高成本等 荧光底物法：采用碱性磷酸酶标记，以磷酸伞型酮作为底物，主要特点：属于酶免疫，其效果取决于采用反应的载体，自动分析能克服酶标的一些缺点 发光底物法 酶标记免疫法：发光底物法 采用碱性磷酸酶标记，以金刚烷衍生物的磷酸盐为底物，它在碱性磷酸酶(AL P) 作用下, 磷酸酯基发生水解而脱去一个磷酸基, 开始裂解并发光，可持续几十分钟。主要特点：属于酶免疫，但发光时间长，效果取决于采用反应的载体，自动分析能克服酶标的一些缺点 酶（标记）化学发光免疫分析 荧光（fluorescence） 发射光的能量来自激发光的能量 即激发一停，发光立即停止，余辉≤10-8s(0.01μs)者 荧光基本不受温度影响 磷光（phosphorescence ） 发射光的能量也来自激发光 激发光停止后，发光还会延续一段时间，即余辉≥10-8s (0.01μs) 又分为短期磷光(余辉10- 8s ~10- 4s )和长期磷光(余辉≥10- 4s) 磷光的衰减强烈的受温度影响 时间分辨荧光免疫分析中作为标记物的稀土离子(如Eu3+、Tb3+、Sm3+和Dy3+)产生的“长寿命荧光”实际就是长期磷光(可长达数十、数百、乃至数千μs) 化学发光(chemiluminescence) 发射光的能量来自发光物的化学(氧化还原)反应，简称“发光” 生命物质的化学发光称为生物发光 发光是常见的自然现象，人们最熟悉的发光生物是萤火虫，在海深2000米以下，多数生物都发光 荧光免疫法 时间分辨荧光免疫分析 酶标记荧光免疫测定，同上节酶标记免疫法中的荧光底物法 荧光偏振免疫测定 Luminex技术：将流式细胞术中的概念创造性地用于高效率平行测定血清成分，是上个世纪末实验室检测技术中最重要的发明之一 时间分辨荧光免疫分析 timeresolved fluoroimmunoassay;TRFIA 以镧系元素作为标记物所建立的免疫测定技术 主要特点：因镧系元素(如Eu3+)所发射的荧光寿命长，在测定特异性荧光时，可通过延迟检测时间而将标本或环境中的非特异荧光扣除，使其具有良好信噪比 时间分辨荧光免疫分析 荧光偏振免疫测定 fluorescence polarization immunoassay，FPIA 荧光物质经单一平面的蓝偏振光(485nm)照射后，吸收光能跃入激发态，随后回复至基态，并发出单一平面的偏振荧光(525nm)。偏振荧光的强弱程度与荧光分子的