蛋白41R对CD8T淋巴细胞的活化、增殖与功能的影响.pdf

摘要 蛋白4．1R对CD8+T淋巴细胞的活化、增殖和功能的 影响 摘要 背景及目的 蛋白4．IR首先是在成熟的红细胞中被发现的，大小为80KD细胞膜骨架蛋白 分子，因为在红细胞膜蛋白SDS．PAGE后位于4．1染色条带处而得已命名。4．1R 是将红细胞跨膜蛋白和血影蛋白．肌动蛋白骨架网络连接起来的桥梁，对维持红 细胞正常形态、粘附、脆性及生理功能中发挥重要作用，人类4．1R基因的表达缺 失会导致遗传性椭圆型红细胞增多症(Hereditarydliptocytosis)，发生溶血性贫 血，红细胞失去正常形态。4．1R基因敲除小鼠的红细胞膜骨架结构改变，细胞膜 表面蛋白分子分布异常。近年来研究发现，4．1R及后来发现的4．1R同源家族成员 4．1N、4．1G、4．1B在有核细胞中广泛表达，其中4．1N主要分布在神经系统，4．1B 主要分布在脑组织，4．1G广泛分布，而4．1R则在红细胞及同样来源于骨髓多功能 造血干细胞的淋巴细胞中高表达。4．1R在成熟红细胞中的功能及作用机制目前已 经研究得比较深入，而4．1R在有核细胞中，特别是在T细胞中的功能及作用机制 还不十分清楚。本课题组成员在前期研究中首次发现并报道了4．1R在CD4+T淋巴 细胞中与免疫突触形成有关，且证实4．1R与LAT(T细胞活化连接子)直接结合 并抑制ZAP一70对LAT的磷酸化，在CD4+T淋巴细胞活化和信号转导的起始阶段发 挥着负调控作用。但4．1R在CD8+T淋巴细胞活化中的免疫生理效应及作用机制在 国内外均未见报道。 CD8+T淋巴细胞活化后形成的效应T淋巴细胞(CTL)可以直接杀伤肿瘤 细胞，分泌细胞因子如：删小IL-2等也可以间接激活机体的免疫系统来增强 机体的抗肿瘤能力。鉴于CD8+T淋巴细胞在抗病毒感染、抗肿瘤免疫、急性同 种异型移植等过程中重要作用，研究4．1R基因表达缺失在CD8+T淋巴细胞活化 中的作用及调控机制显得十分迫切。 本研究通过对美国纽约血液中心引种回国的具有C57BL／6J遗传背景的4．1R 摘要 基因敲除小鼠进行培育和繁殖，利用4．1R基因敲除小鼠和4．1R表达缺失的 细胞周期、细胞因子产生及移植瘤耐受性等方面的影响，为进一步研究4．1R在 CD8+T淋巴细胞活化过程中的作用机制和通路提供实验依据。 方法 本研究采用具有C57BL／6J遗传背景的4．1R基因敲除小鼠和野生型的 C57BL／6J小鼠作为实验模型。 1．无菌取小鼠的淋巴结，免疫磁珠法获得CD8+T细胞，流式检测CD8+T细 胞的纯度。 取总RNA后反转录成eDNA，PCR反应及琼脂糖电泳进行基因型鉴定。测序鉴 定CD8+T淋巴细胞中蛋白4．1R剪切体外显子组成。 CD69的表达，从而分析蛋白4．1R表达缺失对CD8+T淋巴细胞早期活化的影响。 细胞增殖和细胞周期的影响。 5．利用ELISPOT方法，检测4．1R+件和4．1R-／。两种基因型CD8+T淋巴细胞 细胞功能的影响。 6．Western Blot方法比较4．1Ir和4．1R-／‘CD8+T淋巴细胞U叮、ERK磷酸 化水平来分析蛋白4．1R基因缺失对TCR／CD3下游信号的影响。 7．将H22肿瘤细胞分别皮下接种于4．1R+／+和4．1R．／’两种基因型小鼠，比较两 种小鼠对移植瘤的耐受性，从动物整体水平分析蛋白4．1R对CD8+T淋巴细胞功 能的影响。 结果 1．经过磁珠分选的4．1I一+和4．1R-／。小鼠CD8+T淋巴细胞的阳性率分别达到 94％、96．4％，符合后续实验要求。 2．PCR结果显示，基因敲除小鼠的CD8+T淋巴细胞中完全缺失4．1R。测序 ¨ 摘要 完全相同。 3．对4．1R+一和4．1R．／’两种CD8+T淋巴细胞表面的CD69进行流式检测，结 果显示两种CD8+T淋巴细胞在未受到刺激时，CD69的表达极少，但是在细胞 基因型CD8+T淋巴细胞。 的。细胞周期实验结果显示4．1R．／。的CD8+T淋巴细胞的S和G2／M期的百分比 h和48 在第24 h都要高于4．1R+件的CD8+T淋巴细胞。 5．ELISPO