07-体外介绍.ppt

体外分析 以放射性核素或其他非放射性物质标记的配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。 体外分析技术建立的基础 以配体和结合体的特异性结合反应为共同的生物学基础 以结合反应动力学规律作为共同的方法学基础 以对标记物的测量技术作为共同的定量手段 生物学基础：特异性结合反应 抗原-抗体的免疫结合反应； 配基-受体的结合反应； 底物-催化酶之间的酶促反应； 　　 激素-激素结合球蛋白的结合反应。 方法学基础：结合反应动力学规律 遵守可逆反应的质量作用定律： k1, v1 [L]+[R] [RL] k2, v2 定量手段 放射性测量技术 酶定量技术 化学发光定量技术 荧光定量技术 RIA的基本原理 竞争抑制结合反应： 放射免疫分析是在体外条件下，由足量的非标记抗原（Ag）与定量的标记抗原（*Ag）对限量的特异性抗体（Ab）的竞争抑制结合反应。 基本原理 标准曲线的绘制方法 用一系列已知浓度的标准抗原和一定量的标记抗原在一定条件下同限量的特异性抗体进行反应； 在反应达到平衡后，利用适当的分离方法分离B和F； 分别测量B和F的放射性； 用反应变量（如B/F）作为纵坐标，反应剂量作为横坐标（即一系列标准抗原）作一条曲线，就得到不同浓度的标准抗原对反应变量的竞争抑制曲线，这就是剂量反应曲线。 在实际的操作中，一般要设立： 最大结合管（Bo）：标准抗原的量为0，只有标记抗原和特异性抗体时，标记抗原与抗体充分反应后分离B和F，所测得的B的放射性为Bo。这是没有标准抗原与之竞争时，标记抗原和抗体的结合达最大值。 非特异结合管（NSB）：标记抗原除了要和特异性抗体结合以外，还要和一些杂质蛋白或容器的管壁等结合，对我们的分析结果产生影响。NSB管是用蒸馏水代替特异性抗体，在相同条件下反应后测得的放射性。 总放射性管（T）：反应后不分离就直接测得的放射性就是总放射性。表示标记抗原抗体复合物和游离的标记抗原的总放射性。 标准管（B1~Bn）：放有不同浓度的标准抗原，再加入相同量的标记抗原和特异抗体。一般在反应后分离出沉淀，测定沉淀的放射性作为B。 样品管（Bx）：用同剂量的样品代替标准管中的标准抗原，在相同条件下反应和分离，同样取沉淀测得其放射性，就可以在绘制的标准曲线上找到样品的浓度。 标准曲线左：横座标为等份刻度；右：横座标为对数刻度 RIA基本技术 标准品（标准抗原） 标记抗原 抗体 分离技术 标准曲线 标准抗原 是厂家给出已知剂量的非标记抗原。 一般每一个RIA试剂盒里都有浓度由小到大的多瓶标准抗原。 标准抗原的要求 标准抗原与待测抗原、标记抗原具有基本相同的免疫活性，即质同。 他们的化学结构和化学性质要相同，对特异性抗体的亲和力要相同。并且，标准抗原与待测抗原所处的介质条件要相同。 标准抗原的定量要准确： 整个RIA分析系统的定量基础就是标准抗原的量，因此标准抗原的定量一定要准确，即与国家规定的标准品相比有良好的可比性。 只有保证标准抗原的准确定量，才能保证RIA分析系统的准确度和精确度。 标准抗原必须高纯度： 标准抗原应该含有尽可能少的化学杂质，以避免杂质对反应和计量的影响。 标准抗原的稳定性要好： 要保证在试剂盒的运输、储存和在实验过程中应该不发生降解，分离、破坏等。 标记抗原 指抗原分子中有一个或两个原子被放射性核素所取代。 最常用的是125I，因为他的比活度比较高，标记和测量都相对容易，且半衰期合适（60天）利于商品化。 标记抗原的要求 质同，即标记抗原与标准抗原、待测抗原的化学性质和免疫活性要相同。 标记抗原要有适当高的放射性比活度。 比活度高则在允许的相同的测量统计误差的前提下，所使用的标记抗原的量必然减少，那么在反应中与之竞争的待测抗原的量也相应减少，方法的灵敏度就提高了。 但过高的比活度，也会引起诸如辐射自分解和免疫活性受损的问题。 标记抗原要有足够高的放射化学纯度，一般要大于95%。 放射化学纯度不高，可能使一些放射性的杂质对RIA的免疫反应和动力学参数产生影响。 由于存在放射性核素的衰变，因此在长期储存后的标记抗原一般要经过重新提纯后才能再次使用。 标记抗原的稳定性要好： 和标准抗原相比，标记抗原由于有了放射性核素射线的影响，更容易发生分解。 在标记抗原的储存上，应遵循标记化合物的保存原则即低温、降低比放射性、清除自由基等。 特异性抗体 包括多克隆抗体和单克隆抗体。 抗体的质量之间关系到RIA分析方法的灵敏度和特异性。 多克隆抗体一般是用抗原免疫年轻、健康的纯种小动物（一般是羊或兔子）而诱发产生的抗血清。制备的方法成熟、简便、生