实训指导-大肠菌群的测定解答.pptVIP

授课教师：汪清美 （一）大肠菌群的定义及范围 1.定义 指一群在37℃，24h能发酵乳糖、产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 2.检测范围 大肠菌群主要要是由肠杆菌科构成 埃希氏菌属 枸橼酸杆菌属 克雷伯氏菌属 肠杆菌属 其生化特性分类见表 大肠菌群生化特性分类表 ++阳性 ， －阴性， +/－多数阳性，少数阴性 大肠埃希氏菌I型和ш型的特点： 对靛基质、甲基红、 v—P 、枸橼酸盐利用四个项目的生化反应结果均为“++－－”，通常称为典型大肠杆菌。 其它类大肠杆菌则被称为非典型大肠杆菌。 （二）大肠菌群作为粪便污染指标菌的意义义 粪便污染食品，往往是肠道传染病发生的主要原因，因此检查食品中有无肠道菌，这对控制肠道传染病的发生和流行，具有十分重要的意义。 大肠菌群的检出不仅反映检样受粪便污染的程度，也反映了食品在生产、加工、运输、保存等过程中的卫生状况，具有广泛的卫生学意义。义。 （三）食品中大肠菌群的测定 一、检验前准备 (一)设备和材料 温箱、水浴、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、平皿、试管、吸管、载玻片。 (二)培养基及试剂 乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂、乳糖发酵管、革兰氏染液 2．操作步骤 (1)检样稀释 ①以无菌操作将检样25mL(或g或cm2)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作成1：10的均匀稀释液。 固体检样最好用均质器，以8 000～10 000r／min的速度处理lmin。 ②用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液lmL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，作成1：100的稀释液。另取1ml灭菌吸管，按上顶操作依次作10倍递增稀释液。 每递增一次换一只1ml灭菌吸管。 ③根据食品卫生标准要求或对污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。也可直接用样品接种。 (2)乳糖发酵试验 即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产酸产气的细菌。 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在lmL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1mL及1mL以下者，用单料乳糖盐发酵管。 每稀释度接种3管，置36±1℃培养2h，如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，则可报告为大肠菌群阴性；如果有产酸产气者，则按下列程序进行。 (3) 分离培养 将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝或麦康凯等选择性琼脂平板上，置36±1℃温箱内，培养18－24h，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和复发酵试验。 （4）证实实验 目的在于证明从乳糖初发酵实验呈阳性的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆菌，确能发酵乳糖产生气体。 从上述选择性琼脂平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1－2个作革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，观察产气情况。 凡乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即报告为大肠菌群阳性；凡乳糖发酵管不产气或革兰氏染色为阳性，即报告为大肠菌群阴性。 （5）报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml（g或cm2）食品中大肠菌群的最可能数。 3．注意事项 (1)检验步序 大肠菌群的检验步序采用三步法：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。 第一步：乳糖发酵试验是样品的发酵结果，不是纯菌的发酵试验，初发酵阳性管，经过平板分离和证实试验后，有时可能成为阴性。 只做一步初发酵，对某些食品来说，误差是比较大的。这样做，会有相当部分的合格样品被作为不合格样品处理，应予注意。 (2)抑菌剂 大肠菌群检验中经常使用的抑菌剂有胆盐、洗衣粉、十二烷基硫酸钠、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂可抑制杂菌，有利大肠菌群的生长和挑选，但对大肠菌群的某些菌株也有一些抑制作用。 目前乳糖发酵管采用的胆盐剂量(0.5％)是适宜的，在称量时稍有差误，亦不致影响大肠菌群的检出。 (3)挑选菌落 大肠菌群是一群肠道杆菌的总称，大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠杆菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。所以在实