MAPKs信号通路在天然冰片调节血肿瘤屏障通透性中的作用.doc

MAPKs信号通路在天然冰片调节血肿瘤屏障通透性中的作用 邢燕梅,闫晓宁，郭军洽，张荣＊ （广州中医药大学临床药理研究所，广州510405） 脑胶质瘤作为神经系统最常见的恶性肿瘤，占全部颅内肿瘤的40%~50%[1]，对家庭和社会的危害极大，已成为导致死亡的主要肿瘤之一。除了毛细胞型星形细胞瘤及少数位于非功能区、体积较小的胶质瘤可以通过手术根治外，大部分的脑胶质瘤需要在术后辅以放化疗为主的综合性治疗。 在脑胶质瘤中，由于血瘤屏障(blood-tumor barrierBTB)的存在，限制了抗肿瘤药物进入肿瘤组织，从而导致在肿瘤部位不能达到有效的治疗浓度，这也是目前化疗效果一直不甚理想的主要原因之一。已有众多文献报道，冰片在促进药物透过血脑屏障方面具有重要的应用价值。冰片常作为脑部病变的引经药，当其与其他治疗颅脑疾病的药物共用应用时，能够增加药物的脑部靶向性，提高合用药物的脑组织分布，同时可以使药物更加易于透过血脑屏障，增加脑内的药物浓度，提高其脑组织内生物利用度，从而增强药物的治疗效果。但冰片对血肿瘤屏障的影响，至今鲜有文献报道。 课题组前期体内研究显示，天然冰片能选择性开放BTB，增强抗肿瘤药物顺铂、甲氨蝶呤的血肿瘤屏障通透率，提高其脑内生物利用度。体内外实验结果均显示，其选择性开放BTB的机制与可逆性下调紧密连接蛋白Z0-1、F-actin有关[2-3]，但冰片如何调控TJ蛋白的分子机制还需进一步阐释。国内外多项研究显示，MAPKs信号转导通路的激活与脑胶质瘤的发病密切相关。ERK1/2在脑胶质瘤组织中被广泛激活，并且主要聚集在肿瘤细胞核中[4]，提示ERK1/2的激活及易位可能与脑胶质瘤的发生有关。另有临床研究发现，多形性恶性脑胶质瘤病例中，85%以上的病例存在 p-JNK的激活，说明JNK的激活可能促进了脑胶质瘤的发生[5]。此外，在恶性脑胶质瘤组织中，p38的总蛋白表达和磷酸化水平均较正常脑组织明显上调，而且其表达水平与患者预后呈负相关；相反，抑制的活性则可导致肿瘤细胞侵袭性下降，并对化疗药物的反应性增强，说明人类脑胶质瘤的发生与p38通路的激活密切相关[6]。因此，本实验拟在前期成功建立血肿瘤屏障体外模型的基础上，通过检测MAPKs信号通路ERK、pERK、p38、p-p38、JNK、p-JNK的表达，探讨天然冰片调控血肿瘤屏障通透性的分子机制，为冰片进一步应用于临床，改善脑胶质瘤化疗效果提供理论依据。 1 材料与方法1.1 药品、试剂 天然冰片（批号：080922），吉安市林科天然冰片厂；胎牛血清（批号：16050-122）、马血清（批号：10099-141 ），Gbico公司；F12k培养基（批号：21127-022），Gbico公司；DMEM-f12培养基（批号：SME001），Hyclone公司；ERK兔多克隆抗体 （批号：#9102），P-ERK兔单克隆抗体（批号：#4377），p38兔单克隆抗体（批号：#8690），JNK兔单克隆抗体（批号：ab179461），p-p38（批号：#9216），p-JNK小鼠单克隆抗体（批号：#9255），B-actin兔多克隆抗体（批号：AP0060），均购自于广州铎洋生物科技有限公司；HRP标记的山羊抗兔二抗（批号：IH-0011），HRP标记的山羊抗小鼠二抗（批号：IF-0031），北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；六孔Transwell（批号：3450），广州吉泰生物技术有限责任公司；BCA试剂盒（批号：PW0104），莱德尔公司；Western Boting 缓冲液套装（批号：WP001），广州联科生物技术有限公司；凝胶套装（批号：WP002），广州联科生物技术有限公司；预染Marker（批号：PM0033），北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；裂解液（批号：PC901），莱德尔公司。1.2 细胞系 人脐静脉内皮细胞株（HUVECs），购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库，10% 胎牛血清的DMEM-f12培养基常规培养；大鼠脑胶质瘤细胞株（C6），购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库，含有2.5%胎牛血清与15% 马血清的F12k培养基行常规培养。1.3 仪器 多功能酶标仪，PerkinElmer公司；化学发光凝胶成像系统，BIO-RAD公司；垂直电泳仪，BIO-RAD公司；往复振动器，华利达公司。1.4 BTB模型的制备和处理 1.4.1 C6细胞和HUVEC细胞共培养建立BTB模型 24孔transwell板，按照说明书要求添加培养基后，置于37℃培养箱中预先孵育至少4h，备用。2.5%胎牛血清和15%马血清的F12K培养基重悬C6细胞，调整细胞密度1×105/mL，取50μL接种于transwell小室膜的底