第六讲病毒的检测精编.ppt

* * * * * * * 293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，横纹肌肉瘤RD细胞株 * 犬纤维肉瘤细胞 * 绿豆芽酶（Mung bean nuclease）可降解单股核酸，用它可进一步鉴定核酸是单股或双股。 亦可直接用纯化的病毒核酸通过电子显微镜观察，对其进行鉴定，但技术要求较高。 近年来PCR核酸测序技术使得病毒核酸型鉴定的可行性大为增加。 * Dulbecco于1952年建立了空斑试验（plaque assay），其方法是将10倍梯度稀释的病毒样本接种吸附于单层细胞，而后在细胞上覆盖一层含营养液的琼脂，以防止游离的病毒通过营养液扩散，但病毒可在细胞间传递。 经过一段时间培养，进行染色，原先感染病毒的细胞及病毒扩散的周围细胞会形成一个近似圆形的斑点，类似固体培养基上的菌落形态，称为空斑或蚀斑蚀斑（plaque）。 * * 负染是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小 * * * * 空斑形成单位（PFU） 仅计数含20-100个空斑的培养板。 Virus Plaques 病毒的空斑（据Madigan等） 病毒空斑 单层细胞 高稀释度 低稀释度 终点稀释法 终点稀释法（Endpoint dilution assay）用于测定几乎所有种类的病毒滴度，包括某些不能形成空斑的病毒，并可用以确定病毒对动物的毒力或毒价。 使用细胞培养，可通过CPE来判定组织培养半数感染量（TCID50）。 病毒颗粒的检测 电子显微镜技术 最直观的方法是用电子显微镜（Electron microscopy，EM）观察病毒颗粒。 电子显微镜观察法 可放大数十万倍，能观察1nm的微粒。 一些含毒量高的病毒样本，如粪样、鼻拭子浸液或组织匀浆液，可用EM检出病毒。 可用磷钨酸盐等重金属盐直接作负染而后观察，器官组织样本则须作超薄切片后再作负染观察。 前者适用于观察病毒的表面结构如口疮病毒等，后者则可观察细胞内的病毒结构，如冠状病毒、反录病毒在组织中出芽的病毒颗粒等。 血凝试验（Hemagglutination assay） 许多动物病毒，如正黏病毒科、副黏病毒科、腺病毒科的成员，能够凝集某些种类动物（如鸡、小鼠、豚鼠、人）的红细胞。 这些病毒含有可与红细胞结合的蛋白质，如禽流感病毒的囊膜上有一种称为血凝素的糖蛋白，可与红细胞表面的N乙酰神经氨酸糖蛋白结合，引起红细胞凝集。 利用这种特性，可作血凝试验来检测这些病毒的存在。 一般将病毒液在血凝反应板上作倍比稀释，加入红细胞 未凝集的红细胞呈圆点或纽扣状沉于孔底 凝集的红细胞弥漫性格状复盖整个孔 血凝试验 血凝抑制试验 血清学检测 病毒中和试验（Virus neutralization） 针对病毒的一些蛋白质抗原或抗原表位的抗体与病毒结合后可以中和病毒的感染性。 病毒中和试验可以在细胞培养、鸡胚或动物上进行，一般将抗体作稀释，与一定量的病毒混合，然后检测其在细胞培养、鸡胚或动物上的残余感染性。 终点是以抑制细胞病变（细胞培养）或病毒复制（鸡胚或动物）的抗体最高稀释度来表示。 中和试验具有很强的特异性，是检测病毒和新分离病毒毒株的鉴定最经典的方法，也可用于检测病毒感染动物血清中的抗体。 补体结合试验（Complement fixation） 补体结合试验可以用于检测动物血清中的病毒抗体。病毒抗原与抗体的相互反应可以引起补体结合，最终可导致膜溶解。 在补体结合试验中，利用红细胞作为靶细胞，溶血系统作为指示系统，因红细胞膜的溶解易于观察到。 如果存在抗体抗体结合反应，补体结合将发生，后者利用加入结合红细胞抗体（溶血素）的绵羊红细胞可以检测到。 如果补体被病毒抗原抗体复合物结合，则红细胞仍然是完整的；相反，如果补体未被结合，红细胞将在游离的补体的作用下被溶解。 酶联免疫吸附试验（ELISA） 酶联免疫吸附试验可用于样本中病毒的检测和动物血清中病毒特异性抗体的检测，检测病毒抗原可采用夹心法和双夹心法，检测抗体可采用间接法。 病毒核酸的检测 聚合酶链式反应 原理: 设计PCR引物，检测目的片段的大小，DNA测序，比对已知病毒序列。 PCR可直接用于DNA病毒的检测，如果是RNA病毒，则需在扩增之前进行反转录，即提取病毒RNA，加入反转录酶合成cDNA后，再进行PCR扩增，称为RT-PCR M 1 2 3 4 6 5 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 bp 750 2000 1000 500 1099 RT-PCR 主要适用于RNA病毒的检测 也可用于对DNA病毒等的转录水平的检测 核酸杂交 核酸杂交（Nucleic acid hyb