细胞计数及观察研究.ppt

细胞培养（四）;细胞培养的应用价值;节约经费 可生产生物制品、单克隆抗体和基因工程制品等多种产品 ;细胞培养方法的缺点;细胞计数; ?;实验程序： １．制备样品 取悬浮细胞或细胞悬液，稀释到一定比例。２．检查记数板 （1） 擦洗 （2） 冲洗 （3） 镜检 ;３． 加样 先将盖玻片安放在计数室上面，然后摇匀样品取悬液，从盖玻片边缘滴加细胞悬液，连续2~3次，直至充满计数板和盖玻片间的空隙。;;Freshney) ;;４． 计数 （1） 找计数室 在低倍显微镜下寻找计数板上的大方格网位置。（2） 转高倍镜 使细胞和计数室线条均清晰为止。然后将计数室一角的中格移至视野中。（3）计数 计算计数板的四角大格内的细胞数，压线者只计算左侧和上方的，右和下的不计算在内。 （4） 清洗; 细胞数计算公式： 细胞数/毫升培养液 = ;;;注意事项： 1、??? 加液时勿使液体漫过盖玻片或出现气泡。 2、??? 镜下计数，有时偶尔有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。 3、??? 如细胞团占10%以上，说明消化不充分，或细胞数少于200个/10平方毫米或多于500个/10平方毫米时，均说明稀释不当，需重新置备细胞悬液，再重新计数。;;;;Hand Tally Counter ;;培养细胞一代生存期;细胞一代与细胞世代（Generation）或倍增〔Doubling〕不同，在细胞一代中，细胞能倍增3～6次。 ;细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段： 1．潜伏期 2．指数增生期 3．停滞期 ;;1．潜伏期（Latent Phase）;细胞贴壁后，还需要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期，这一阶段称为细胞潜伏期。 细胞处在潜伏期时，可有运动活动，但基本无增殖，分裂相鲜见。 当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。;细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。 初代培养细胞潜伏期长，约24～96小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24小时。 细胞接种密度大时潜伏期短。;这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。 指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。 一般以细胞分裂指数（Mitotic Index：MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。;体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。 一般细胞的分裂指数介于0.1%～0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%～5%。 pH和培养液血清含量变动对细胞分裂指数有很大影响。;指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。 在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3～5天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。;细胞接触抑制（Contact Inhibition）;细胞密度抑制（Density Inhibition）;3．停滞期（Stagnate Phase）;细胞生长相关指标;二、细胞传代;一）、悬浮细胞的传代培养;二)、贴壁细胞的传代培养;消 化;二、活细胞的观察 细胞活力 ---- 在细胞群体中活细胞所占的百分比叫做细胞活力 由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。 复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。;(一)台盼兰染色操作步骤： ? 1、制备细胞悬液。2、以1：1的比例加入0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计算细胞活力。;死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。?;(二)染色法原理：　利用活原生质体有选择吸收外界物质的特性，用染料处理时，活原生质体不吸收染料，细胞未染上颜色，而死细胞立即吸附大量染料而染上颜色。 细胞活力（%）= 未染色的细胞数/观察的细胞总数 × 100;（三）相差显微镜直接观察法 相差显微镜（phasecontrast microscope）由P．Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。 这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。;基本原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 操作方法：直接将培养的细胞（细胞培养瓶、培养皿）放置在相差显微镜的光路中，即可直接观察。;相差显微镜观察注意事项： 1、培养器皿质量过关 2、原代培养的细胞或将要传代