WB实验步骤.docVIP

 PAGE \* MERGEFORMAT 6 附录一 Western blotting实验步骤 1．组织总蛋白样品制备： 取适量组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。将组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清，样品分装冻存于-20℃备用。若浆液很粘稠则可能是DNA和蛋白形成的胶粘物，可以用微量移液器反复吹打得以解决。（吹打过程中应避免混入过多的空气而形成泡沫） 细胞总蛋白样品制备： 对于悬浮细胞：离心收集细胞，每106细胞加250 ul细胞总蛋白提取试剂（在使用前数分钟内加入cooktail+磷酸化蛋白酶抑制剂），振荡。 对于贴壁细胞：? 用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。加入适当体积的细胞总蛋白提取试剂（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。? 12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 2 .测定蛋白浓度： 2.1 按50：1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。BCA法是测量总蛋白含量的,它作为参照指标可以作为western的参考数据,若不测蛋白浓度可以用以下两种方法简单估算：一种方法是利用后来的SDS图的条带估计,一种是加入内参检测,这个很多人使用,可以参考. 3 SDS电泳：3.1 制 胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地 注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳： 将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质， 疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。 3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样buffer混匀，沸水煮10分钟。上样前可适当将样品震荡混匀后再使用。 3.4 加 样： 预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul如果样品上样较多可以适当增加样品缓冲液的量10-25ul 。 3.5 电 泳： 加样完毕，选择90V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约40分钟），更换至120V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。理论上电泳电压越小泳道中条带形状越好，分离效果也越好。时间允许的情况下可以适当减小电压。 4．转 膜： 4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。 4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm，PVDF膜长宽较 凝胶大0.5~1mm）滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10% 甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟， 进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：正极-海绵-双层滤纸-PVDF膜-凝胶-双层滤纸-海绵-负注意正负极要正确。插上电源，设定恒压20V转膜，4℃冰箱中过夜。若实验时间较紧，则可以采取200mA恒流转印1h-1.5h 夹入海面、滤纸和膜后对好正负极（其中不能留有气泡），卡紧转膜板，电转槽中倒满电转液，将转膜板浸入电转槽中， 膜的封闭: 用TBSTP