实验二植物基因组DNA的提取研讨.pptVIP

植物基因组DNA的提取 2013级生物技术专业 分子生物学实验报告 姓名： 学号： 实验项目：实验二 植物基因组DNA的提取 1.实验目的 2.实验原理 3.实验试剂 4.实验步骤 5.实验注意事项 6.思考题 * * 背景知识 植物细胞中有哪些细胞器中含有DNA？ 与动物细胞的差别？ 背景知识 DNA的存在形式 背景知识 DNA的存在形式 背景知识 DNA的存在形式 核苷酸 双螺旋结构 一级结构-核小体 二级机构-螺线管 三级结构-超螺旋管 四级机构-染色体 +组蛋白 背景知识 DNA的存在形式 DNA为白色类似石棉样的纤维状物，大都呈酸味。 DNA一般都溶于水，不溶于醇类、氯仿等有机溶剂，在高盐溶液中的溶解度最大。 在酸性溶液中易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。 DNA的理化性质 实验目的 掌握CTAB法提取植物DNA的原理 掌握CTAB法提取植物DNA的实验方法 注意：此方法会把少量RNA提取出来，故后面通称核酸的提取。 实验原理 核酸-蛋白质复合体 CTAB-核酸复合体 +CTAB 蛋白质变性剂 蛋白质变性除去 +高盐溶液 溶解 +沉淀剂 沉淀核酸 新鲜菠菜叶片 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、氯化钠、Tris饱和酚、异丙醇、β-巯基乙醇、无水乙醇、氯仿、异戊醇、液氮、聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40) 实验材料 实 验 仪 器 离心机：3台/12管 水浴锅：65℃ 研钵：10个 移液枪（包括枪头） 实验试剂 2%CTAB抽提液：250ml CTAB 4g 无水乙醇 5ml 蒸馏水 100ml 200ml烧杯 5 mol/l NaCl 56ml 1 mol/l Tris-HCl(PH8.0)20ml 0.5mol/l EDTA 8ml 定容至250ml 高压灭菌冷却后 121℃ 20min 1% β-巯基乙醇 2ml PVP-40 5g 4 ℃保存 实验试剂 氯仿:异戊醇=24:1 100ml 氯仿 96ml 异丙醇 4ml 4 ℃保存 TE 缓冲液（保存 DNA） PH8.0 50ml 10mmol Tris-HCl(PH8.0) 0.5ml 0.5mol/l EDTA(PH8.0) 0.1ml 定容至50ml 调PH8.0 高压灭菌冷却后 121℃ 20min 4 ℃保存 酚:氯仿:异戊醇=25:24:1 40ml 取20ml前面配制的氯仿-异戊醇+20mlTris饱和酚 2.破碎细胞，释放溶解核酸 快速研磨成粉末 轻摇匀 取出冷却2分钟 液氮 1ml 65℃ CTAB抽提液 1g 菠菜叶片 65 ℃水浴锅 40分钟 每10分钟轻摇 10ml 离 心 管 预冷的 研钵 实验步骤 1.准备工作 蒸馏水洗净，晾干，剪小备用 CTAB抽提液 65 ℃水浴锅 预热 3.抽提去除蛋白质 2. 1ml酚-氯仿-异戊醇 振荡 2分钟 12000 r/min 离心10分钟 10ml 离 心 管 分层 上清液 核酸-CTAB 变性蛋白 有机溶剂 10ml 离 心 管 2ml氯仿-异戊醇 颠倒混匀 12000 r/min 离心10分钟 分层 变性蛋白 有机溶剂 上清液 核酸-CTAB 上清液 核酸-CTAB 实验步骤 4.沉淀核酸 上清液 核酸-CTAB -20℃ 异丙醇2.5ml 10ml 离 心 管 室温 沉淀 10000 r/min 离心10分钟 5. 核酸的洗涤、脱盐 400ul无水乙醇 去上清液 10000 r/min 离心10分钟 6. 核酸的保存 100ulTE缓冲液 5. -20℃ 保存 实验步骤 慢摇30秒 室温15分钟 在整个实验过程中应严格执行无菌操作； 部分药品有毒，操作中应注意安全防护； 磨样时最好是加液氮，磨样速度要快，使材料处于低温状态 。 刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔！ 抽提时不要有太力振动，操作也要仔细，尽量避免DNA断裂。 将DNA加入异丙醇时用的枪头一定要剪过的。这点很重要。过尖的枪头会把DNA链弄断。?? 注意事项 思考题 本实验中用到的各种试剂的作用是什么？ 本实验中进行了几次离心操作，每次的目的？ 实验安排 按照学号分组进行实验，每6人一组，一组做3管，用一个研钵。每3组共用1台离心机同时进行离心操作。 6人一组 实验报告 *