环介导等温扩增技术课题.pptxVIP

环介导等温扩增技术2015307360吴祖雄环介导等温扩增原理定义：针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下，60--65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现10^9～10^10倍的核酸扩增。①扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特性的BstDNA聚合酶②需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物③LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及进行温度循环针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’端的F3c、F2c和Flc区以及5’端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。LAMP反应的开始阶段四条引物都被使用，但在循环阶段则只有内引物被使用。FIP(ForwardInnerPrimer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。F3引物：上游外部引物(ForwardOuterPrimer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。BIP引物：下游内部引物(BackwardInnerPrimer)，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5’端的Blc区域序列相同。B3引物：下游外部引物(BackwardOuterPrimer)，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。环介导等温扩增引物设计环介导等温扩增引物设计LAMP反应引物与对应模板区域环介导的等温扩增技术原理第1步：内引物FIP的F2与其模板的互补序列F2c结合，在BstDNA聚合酶作用下，从F2的3′末端开始启动DNA合成，合成一条以FIP为起始的新的DNA单链，并与模板链结合形成新的双链DNA。而原DNA双链中与模板链互补的非模板链将被取代而游离于反应液中。环介导的等温扩增技术原理第2步：原合成的以FIP为起始的DNA单链被置换而脱离，成为单链DNA，其在5′末端F1c和F1区发生自我碱基配对，形成茎环状结构。环介导的等温扩增技术原理第3步：引物BIP的B2与模板链B2c区互补配对，合成以BIP为起始的新链，并与模板链互补形成DNA双链。同时，F端的环状结构将被打开，外引物B3与模板上B3c杂交后，以其3末端为起点也开始合成新链，并使BIP为起始的DNA单链从模板链上脱离下来，形成以FIP和BIP为两端的单链。整条链呈现哑铃状结构，此结构即为LAMP的基础结构.环介导的等温扩增技术原理环介导的等温扩增技术原理环介导等温扩增核酸技术优势产物的检测反应结束后，对扩增产物常进行焦磷酸镁沉淀检测（浊度检测）、荧光检测、凝胶电泳检测、实时检测。浊度检测：在LAMP反应过程中，会产生一种叫焦磷酸镁的衍生物。由于LAMP能产生大量的扩增产物，衍生物的产量也会大增，于是呈现出白色浑浊。因此，通过观察白色浑浊的有无，可验证是否有靶基因存在。荧光检测：钙黄绿素（螯合剂）与试剂中的锰离子结合后处于淬灭状态。扩增反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释放钙黄绿素，使钙黄绿素的淬灭状态解除，发出黄绿色荧光。反应后加荧光染料法的优点是灵敏度较高，在直接观察不能准确判断结果时，加入荧光染料可增加其可视性，提高判断的准确度环介导等温扩增核酸技术优势LAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模板的缺点，避免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的连续快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。操作简单：只需一个水浴锅快速高效：不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成 的时间损失特异性强：针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。 高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在300 bp以内。500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。灵敏度高易造成假阳性结果。环介导等温扩增核酸技术的应用LAMP可用于病原菌、病毒的检测及鉴定，还可对DNA进行定量分析；该方法用于单核苷酸多态性分型更灵敏准确，不仅能够促进多基因性疾病的研究，还能决定临床药物的使用及用药量。目前，已建立起多种病原菌、病毒的LAMP检测法。环介导等温扩增核酸技术的应用流行性乙型脑炎病毒的检测：杜鹃等建立了流行性乙型脑炎病毒一步法RT-LAMP检测方法，对GenBank中登录的25株JEV基因序列进行分析，设计该基因保守区域的RT-LAMP引物，其中包括2条外引物F3／B3，2条内引物FIP／BIP和2条环引物FLP／BLP。在LAMP反应体系中加入逆转录酶和RNA模板，65℃水浴60min，反应可一步完成。环介导等温扩增核酸技术的应用犬细小病毒的检测：杨慧等建立了犬细小病毒LAMP检