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GatewayCloning原理利用Site-specificrecombination（位點專一性重組）的特性在原核生物中最為典型。這種重組依賴小範圍的同源序列聯會，重組只限於在這一小範圍內，其重組只涉及特定位置的短同源區或是特定點鹼基序列之間原理λ噬菌體DNA有兩種存在型式：裂解狀態：噬菌體DNA在被感染的細菌中以獨立的環形分子結構存在溶源狀態：噬菌體DNA整合到宿主基因組中，成為細菌染色體一部分為了進入溶源狀態，游離的λ噬菌體DNA必須整合(integrate)到細菌DNA中去；而為了向裂解狀態轉化，原噬菌體DNA必須從細菌染色體DNA上切除(excise)這兩種類型間的轉換即整合和切離，都是通過λ噬菌體DNA和細菌DNA之間的位點專一性重組實現的，這些特定位點叫做附著點(attachmentsite，att)細菌染色體上的附著點稱為attB，長度大約25bp，位於bio和gal基因之間，分為B、O、B3個序列組分噬菌體的附著位點稱為attP，由P、O和P三個序列組成，長度為240bp機制DNA的整合反應涉及attB和attP的核心序列(O序列)中鏈的割裂與重接首先在attP和attB位點上產生同樣的交錯切口，形成了5-OH和3-P的末端，交錯切口的5單鏈區長7個鹼基。attB和attP兩個核心區的斷裂完全相同，同位素標記試驗證明，連接過程不需要任何新的DNA合成整合反應中，attB和attP兩個位點結合後，Int蛋白具拓撲異構酶I的活性，使兩個DNA分子的每一個單鏈斷裂，在一瞬間旋轉以後仍然在Int作用下連接成半交叉，形成重組中間體，即Holliday結構。接著另外兩個單鏈通過相同的過程斷裂重接，這樣便完成了整合過程。機制機制實驗目的將目標基因接到帶有特定序列的載體上Ex.將TCP接到帶有YFP的載體上TCPTCPYFP實驗流程Step1 將PCR產物(目標基因)接到帶有attL1、attL2的載體(TOPO-D)TCPTCP實驗流程Step2 讓帶有目標基因的載體(TOPO-D)和帶有我們所需特定序列及與attL1、attL2的同源序列attR1、attR2之載體(Destination4C1)產生互換同源序列產生互換，並將目標基因重組TCPYFPattL1attL2attR1attR2ccdB致死基因kanamycinspectinomycin實驗流程Step3 互換後可得到四種結果：以spectinomycin篩選 spectinomycinTOPO-D載體需kanamycin含致死基因ccdBspectinomycin1234沒換有換實驗流程結果 限制位點酶切與Gateway比較