色谱分离方法精编.docVIP

色谱分离方法[1] 根据分离原理还可将色谱法分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱、电泳色谱、气相色谱等。利用物质吸附能力不同进行分离的称为吸附色谱，常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭、大孔吸附树脂等。利用物质在两相不互溶的溶剂中的分配比不同进行分离的称为分配色谱，常用的支持剂有硅胶、硅藻土、纤维粉等，液滴逆流色谱（DCCC, droplet counter current chromatography）和高速逆流色谱(HSCCC , high speed counter current chromatography)则是在分配色谱与逆流分溶相结合的基础上发展而成的一种新技术。利用物质解离程度不同进行分离的称为离子交换色谱，常用的离子交换树脂有强酸型（磺酸型）、强碱型（季胺型）、弱酸型（羧酸型）、弱碱型（三级胺型）等。利用物质分子大小不同进行分离的称为凝胶色谱（亦称分子筛或排阻色谱），常用的支持剂有葡聚糖凝胶、羟丙基葡聚糖凝胶等。利用电流通过时，离子趋电性不同进行分离的称为电泳色谱，常用的有纸电泳、琼脂电泳、凝胶电泳等。本书将根据其在天然药物分离工作中的重要性择要介绍。 色谱法的特点是分离效果好，对于经典方法难以得到分离的化合物采用色谱法往往可以得到满意的分离，但对于所用的吸附剂或支持剂、试剂、仪器设备等要求较高，技术操作较细致，操作周期也较长，故在工业生产中用得较少，目前主要是作为一种实验室常规分离方法用于天然药物中生物活性成分及化学成分的研究。 由于天然药物中有效成分的结构类型不同，理化性质也不同，所以选择的色谱方法也是不同的，要根据具体情况选定。 通常生物碱的分离可选用硅胶或氧化铝色谱，对于极性较强的生物碱可选用分配色谱或反相色谱，对于碱性较强的生物碱可选用离子交换色谱，对于水溶性生物碱如季胺型生物碱、氮氧化物生物碱等也可选用分配色谱或离子交换色谱。 苷类化合物的色谱分离与苷元的性质有关，对于水溶性较大的苷如皂苷、强心苷等通常采用分配色谱或反相色谱分离，对于水溶性较小的苷则可采用吸附色谱分离。 挥发油、甾体、萜类、萜类内酯（成苷者除外）等往往首选硅胶及氧化铝色谱，若在氧化铝色谱上有次级反应，则宜用硅胶吸附色谱分离。 黄酮类、醌类等含有酚羟基的化合物则可采用聚酰胺色谱进行分离。 有机酸、氨基酸等含有羧基或氨基类的化合物通常可选用离子交换色谱进行分离，有时也可用分配色谱进行分离。氨基酸类化合物还可采用活性炭色谱进行分离。 对于大分子化合物如多肽、多聚糖、蛋白质以及极性较大的化合物则通常采用凝胶色谱进行分离。 第一节 硅胶柱色谱 硅胶色谱是最常用的色谱方法，适用于亲脂性成分的分离，广泛用于萜类、甾体、强心苷、苯丙素、黄酮、醌类、生物碱等类化合物的分离。它具有价廉、分离效果好、再生容易、适用范围广、不易与有机酸、酚类以及色素等类化合物形成不可逆吸附，样品损失较少、回收率较高、副反应较少等优点。但与氧化铝色谱相比，具有分离效果较差、样品处理量较少、对杂质的吸附能力较差等缺点。 硅胶吸附色谱 （一）．色谱柱的选择 有多种多样的色谱柱可供选择（见图2-1）。下端带有玻璃塞的或不带有玻璃塞的以及带有垂熔筛板的均可选用 。吸附色谱所用的洗脱剂均为有机溶剂，因有机溶剂可溶解在玻璃塞上起润滑和密封作用的凡士林，故对玻璃塞的密封和润滑需要用淀粉甘油糊，而不能用凡士林。在用不带有玻璃塞的色谱柱时，含氯的溶剂如氯仿、二氯甲烷等对胶管的腐蚀很大，常会导致胶管的膨胀和变形，在使用时要经常检查下端连接的胶管，以防洗脱剂发生泄漏，造成柱中的洗脱剂流干，导致分离的失败。柱内径与柱长之比通常为1:10－1:20,若柱粗而短，则分离效果较差。若柱过长而细，分离效果虽好，但流速慢，消耗时间太长。样品长时间吸附在硅胶上和长时间被光照射会使样品中的某些成分发生变化，过长的柱子装填均匀难度也较大，故通常对于分离复杂样品常先使用短而粗的柱子进行粗分，然后对于已经过粗分且成分相对较简单的样品再用细而长的柱子进行分离。所用的色谱柱应比装入吸附剂的柱长再长一段，以备存有一定量的洗脱剂。为了防止溶剂的挥发及减少溶剂的加入次数，色谱柱上可覆一玻璃瓶或装一个分液漏斗，内存色谱用溶剂。 （二）．吸附剂的用量 吸附剂的用量要根据被分离样品的组成及其是否容易被分开而决定。一般来说，吸附剂用量为样品量的20－50倍。若样品中所含成分的性质很相似，则吸附剂的用量要加大，可增至100倍或更大些。硅胶对极性较小的化合物如萜烯、倍半萜烯等的吸附力较弱，其用量应加大，可为样品量的100－200倍。 （三）．装柱方法 色谱柱要求填装均匀，且不带有气泡。若松紧不一致，则被分离物质的移动速度不规则，影响分离效果。装柱时首先将色谱柱垂直的固定在支架上，在管的下端塞少许棉花，使