生化与分子生物学研究思路与技术-陈汉春概述.ppt

生化与分子生物学研究思路与技术;生物化学 :;一.生物化学研究的目的：; 二.生物化学的研究对象：;三.生物化学研究的发展： ;叙述生物化学(descriptive biochemistry)阶段(1770～1903) ;我国人民在公元前二十一世纪，已用曲酿酒，称曲为酒母，又叫做酶；公元前十二世纪，已将豆、谷发酵，捣烂、加盐以造酱，并制出麦芽糖，当时称为 “饴”。公元九世纪或十世纪已制成豆浆和豆腐。;2. 动态生物化学(dynamic biochemistry)阶段（1903～1950） ;此阶段中国人民的贡献：;3. 功能或分子生物化学（functional  or molecular biochemistry）阶段  （1950年至今） ;此阶段中国人民的贡献：;四.生化研究的基本思路 和技术路线：;1 .细胞器和生物分子的分离：;要了解生物分子的结构，首先必须得到纯化的生物分子。用于分离和纯化生物分子的方法很多，例如盐析法、层析法、凝胶过滤、电泳、超速离心等。要得到均一性的生物分子往往需要综合性采用多种方法。;亚细胞器/单位;2 .生物分子的结构确定 ：;3 .生物分子的功能和代谢分析：; 策略;2）生物分子的代谢分析：;某些氨基酸、糖和脂肪酸可以与一个合适的稳定同位素结合，然后注入动物体内或用于体外实验来观测它们的代谢过程。这些研究证实代谢是一个很活跃的过程，细胞内大部分复合物都在不停地合成和降解。 ;五.分析生化反应的总体策略 ：;六.生化研究技术的进步： ; 1.细胞器及生物分子的分离与纯化： ;基本技术：; 1）匀浆:; 使样品绕离心机转轴的中心旋转而获得一个 远大于地球重力的沉降应用力，样品介质中 不同大小、形状和密度的颗粒将以不同的速 度沉降。 影响因素: 离心力(转速及颗粒与中心轴的 距离)，颗粒的大小、形状、密 度，介质的粘度。 ;低速离心: ≤6 000 r/min 、室温， RCF (相对离心力)≤6 000 g 。 高速离心: 6 000 ～25 000 r/min 、低温， RCF = 6 000 ～ 60 000 g 。 超速离心: 25 000 r/min 、低温 + 真空， RCF = 60 000 ～ 600 000 g 。 差速离心: 连续用几种递增的离心速率离心。 密度梯度离心: 样品中不同组份在离心力场的 作用下停留于相应密度的支持物 层面。; 根据样品中各组分物理生化特性、分子大小形状、所带电荷、挥发性、溶解性及吸附性或亲和性等的不同而将它们分离。 类型: 吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤、疏水相互作用层析、亲和层析、共价层析和金属螯合层析。 ; 常用层析法:; ①薄层层析和纸层析:; ②柱层析:;32; 4）电泳：; 电泳支持物:; 电泳缓冲系统:; 常用电泳技术:;①基本电泳: 纸电泳、醋纤膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、 聚丙烯酰胺凝胶电泳。 ;38;②等电聚焦: 在pH梯度下进行。pH梯度由结构类似的小分子量两 性电解质形成，等电点(pI)在pH 3～10之间。当存 在外加电场时，每一种两性电解质向其pI值处移动 而形成稳定的pH梯度。 电泳过程中每一种带电分子都朝自己的pI位置移动 而被分离。; ③毛细管电泳:; ④双向电泳;42;2D gel in proteomics;点匹配结果:;2.生物分子的分离与纯化：; 1）蛋白质纯化:; 2）DNA提取:;基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱 M: λ DNA/HindIII 分子量标准， 泳道1～4分别代表4个不同样品的基因组DNA; 3） RNA提取:;总RNA和mRNA的琼脂糖凝胶（1％）电泳图谱;七. 生物分子的结构与功能分析：;分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成;通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列; 2. 酶活力检测:; 3. 蛋白质组学分析:; 4. DNA序列分析:; 5. 聚合酶链反应（PCR）:;在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。;DNA-DNA 杂交双链分子; Southern