何涛20104720209G蛋白偶联受体提取方法.docxVIP

G蛋白偶联受体的提取方法 本文主要参考论文 《High-Level Production, Solubilization and Purification of Synthetic Human GPCR Chemokine Receptors CCR5,CCR3, CXCR4 and CX3CR1》已及专利《G蛋白偶联受体的提取方法》 。前一篇文献说明了如何构建人类G蛋白偶联受体高表达的大肠杆菌工程菌以及以其发酵液为原料提取G蛋白偶联受体；后一篇文献是对第一篇文献中G蛋白偶联受体的提取方法的改进，使其适合于规模化制备。 第一篇文献关于G蛋白偶联受体提取的内容及个人看法： PS：括号内为查资料所得或个人看法 取1L发酵液，加入50mL破碎缓冲液，搅拌混匀，然后在-82℃和42℃下反复冻融3次，再在1.8KPa下通过French Press 细胞破碎仪；（破碎缓冲液为加有EDTA、DTT、PMSF、溶解酵素以及甘油的PBS缓冲液，EDTA为离子螯合剂，PMSF为蛋白酶活性抑制剂，可以防止G蛋白偶联受体被降解） 将细胞破碎液在10,000g下离心1h，得上清液1；（去除细胞碎片、细胞器及内含物） 将上清液1在100,000g下高速离心1h，取下层沉淀；（100,000g下离心去除细胞间质,下层沉淀为膜组分粗提取物） 往沉淀中加入20mL膜洗液，将沉淀吹散，在100,000g下高速离心1h，下层为清洗过的膜组分；（膜洗液为加有EDTA、PMSF以及甘油的PBS缓冲液，清洗以进一步除杂，100,000g下离心形成膜组分微粒体） 往下层物质中加入10mL助溶剂，4℃下慢速摇晃过夜，第二天将混合液100,000g下高速离心1h，得上清液2；（助溶剂为加有PMSF、1%FC-14及甘油的PBS缓冲液。FC-14为表面活性剂，可以促使G蛋白偶联受体溶解） 将上清液2上柱，层析柱为螯合有Ni2+，柱体积为5mL，上柱前已用A洗液做过平衡预处理；然后依次用（5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%）B洗液+A洗液进行洗脱，收集第3次到第15次的洗脱液；（A洗液为加有0.02% FC-14, 25 mM 咪唑的PBS缓冲液，B洗液为加有0.02% FC-14, 500 mM 咪唑的PBS缓冲液；A为柱结合缓冲液，B为洗脱液） 将洗脱液用装有Ultracel-50超滤膜Amicon Ultra-15 离心超滤管进行超滤，截留液即为高纯度的G蛋白偶联受体。（Ultracel-50超滤膜可以截留50kDa以上的蛋白质，G蛋白偶联受体通常为100-300kDa） 第二篇文献关于G蛋白偶联受体提取的内容及个人看法： 1、通过离心取250mL发酵液中的菌体，加入40mL的PBS缓冲溶液处理30min以上(50mM, pH8. 0,表面活性剂Fos choline-14(FC-14)浓度为1-5 % (w/v))，然后超声破碎1h, 10000g离心30min,取上清液35mL，将上清液稀释50-100倍；（稀释是为了减小表面活性剂Fos choline-14(FC-14)的浓度，使蛋白质复性） 2、利用截留分子量为100-300kDa的平板式超滤膜(聚醚矾材质，0. 09m2)对步骤2获得的上清稀释液进行分离浓缩至截留液体积为200mL左右。超滤膜进料口和出料口的操作压力分别为:0.03MPa和0. 07MPa，流速为:3. 8L/h; 3、将步骤(3)获得的截留液冻干后，得到固体G蛋白偶联受体,产品经SDS电泳分析，G蛋白偶联受体纯度高于80 % 。 三、两种方法的流程比较及个人看法： 流程比较： 离心发酵液，取得菌体 加破碎缓冲液,冻融,破碎细胞 10,000g下离心1h，取上清液 加PBS缓冲溶液处理30min以上，超声破碎1h 将上清液100,000g下高速离心1h，取下层物质 10,000g离心30min,取上清液，并稀释50-100倍 加助溶剂，4℃下慢速摇晃过夜，100,000g下高速离心1h，取上清液 加膜洗液，100,000g下高速离心1h，取下层物质 用截留分子量为100-300kDa的平板式超滤膜对上清稀释液进行分离浓缩 将截留液冻干，得到固体G蛋白偶联受体 洗脱液用装有Ultracel-50超滤膜Amicon Ultra-15 离心超滤管进行超滤 上清液过螯合有Ni2+的层析柱 得到G蛋白偶联受体 个人看法： 通过比较两者的流程图以及参考图1-1，可