1.2基因工程的基本操作程序(上课)资料.ppt

1.2 基因工程的基本操作程序;复习:基因工程的基本操作步骤;一、目的基因的获取;3.从基因文库中获取目的基因;基因组文库的构建模式图;反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因，再与载体连接后储存在一个受体菌群中。;;;补：原核细胞的基因结构;;;②如何从基因文库中得到所需要的基因;利用PCR技术扩增目的基因;原理： DNA双链复制;;PCR技术与体内DNA复制的区别：;为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？;2.基因表达载体的构建 ;启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质;终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录;不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录； ;（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。;将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？;常用的受体细胞：;（1）导入植物细胞 农杆菌：具有趋化性（酚），感染双子叶植物和裸 子植物， 转化示意图; 根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出农杆菌不能将目的基因不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?;（2）导入动物细胞 显微注射技术;显微注射技术; 1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。---感受态细胞 2）使含有目的基因的重组质粒溶于缓冲液中与感受态细胞混合，一定温度下完成转化过程 ; 不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。;4. 目的基因的检测与鉴定;基因探针（DNA探针）与目的基因杂交， 有无杂交带;检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体DNA上; 利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？; β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？ ;（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。 （2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。 （3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。 （4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。 ;1）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来;2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA;3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制酶可用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶;4）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的