3基因表达检测资料.ppt

第三部分：基因表达检测;基因表达检测的应用范畴;基因表达检测的技术手段;RT-PCR (qRT-PCR) ; mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR； RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。;总RNA 提取;被污染的试剂，缓冲液 移液器 使用的器皿及tip等 操作者的手、口、头发等 ;处理并专用：移液器、玻璃器皿、离心管、枪头、溶液、缓冲液、RNA电泳装置用0.1％的DEPC在37oC处理溶液1小时后，有的再高压蒸气灭菌15 min，烘干备用； 180－300oC烘烤玻璃器皿4hrs以上或用其它灭活RNA酶的商品化产品处理塑料制品； 也可使用新的、无RNA酶的一次性tubes, tips等； 在分离RNA的过程中用RNA酶抑制剂以抑制RNA酶的活性。;RNA酶抑制剂;实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳 带评价RNA质量 实验材料：水稻幼嫩叶片 ;苯酚/氯仿反复抽提 ，价廉但质不优，尤其是对多酚等含量高的材料不适 蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法 强变性剂法。硫氰酸胍，盐酸胍等，可 配合氯化铯离心或有机溶剂提取。 Trizol Reagent;利用Trizol试剂抽提植物总RNA原理;75％乙醇（in DEPC-treated water) 氯仿、异丙醇（RNA专用） RNase-free water：Draw water to RNase-free glass bottles. Add diethylpyrocarbonate （DEPC）to 0.1% . Let stand overnight and autoclave. 防止外源RNase的污染： 应戴口罩和手套，环境洁净； 玻璃器皿180oC烘烤3 hrs以上； 一次性用品如tube、 tip、塑料制品等使用DEPC蛋白质变性剂处理，或者用新的、无RNA酶的产品； 电泳槽相关的用0.4M 的NaOH处理，再用DEPC水洗3遍。;操作步骤;RNA的琼脂糖凝胶电泳进行质量检测;What does good or bad total RNA look like when separated in gel? ;RNA降解的主要原因;RNA产量低的原因;RT-PCR (Reverse transcription PCR) ; 目前PCR技术只能扩增DNA模板，对RNA模板不能直接扩增。mRNA反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增，这种在mRNA反转录后进行的PCR扩增称为RT-PCR。 RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。; DNase I: 是将单链或双链DNA同等程度的随机分解，生成具有5’－P末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。体外转录后除去模板DNA。;本实验以水稻叶片RNA为材料，检测水稻种子大小基因GS5突变体(或内源任意基因)的基因表达； 实验中设置一个内参基因作为阳性对照，判断RNA的定量及反转录、PCR等过程是否有问题； 设置一个不加模板RNA的阴性对照，主要是消除DNA及PCR试剂方面引起的假阳性； 同时设置一个以叶片DNA为阳性对照，检验扩增带型是否来源于反转录的cDNA。;操作步骤（一）RNA Preparation;操作步骤（二）Reverse Transcriptase Reaction ;在冰上配制下列反应体系 : First strand cDNA 2?l Taq (5 u / 1 ?l) 0.3 ?l 10 × Ex Taq buffer 2 ?l dNTP mixture (2 mM) 2 ?l Primer F (10 mM) 0.25 ?l Primer R (10 mM) 0.25 ?l ddH2O 13.2 ?l ;Taq酶过多； Mg2+浓度不合适：Optimize [Mg2+] in a ladder of 0.5 mM; 引物不特异、浓度过高、Tm值过高、引物形成二聚体; 复性温度过低：三度幅度梯度提高; 循环次数过多； 模板量过多。;点样或染胶问题; 反应体系中忘记加入某种成分(无扩增产物）或分装mixture时出了问题； 目的片段太大，使用的DNA Polymerase无法扩增出目的片段