SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳资料.ppt

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量;实验原理;聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)： 以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的一种区带电泳。 ;聚丙烯酰胺凝胶的特性： 聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制。丙烯酰胺的浓度可以在3～30％之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，高浓度凝胶具有较小的孔径。当相对分子质量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离时，阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率，称为分子筛效应。;不连续的凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳又常分为两大类，第一类是连续的凝胶电泳，第二类是不连续的凝胶电泳。 　连续系统电泳体系中缓冲液、pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。;浓缩效应可显著提高聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率，该效应可通过引入浓缩胶和不连续缓冲溶液系统而获得。 浓缩胶处于分离胶的顶部，因此样品在进入分离胶之前首先要经过浓缩胶。它是由较低浓度的丙烯酰胺构成，当样品经过浓缩胶时由于胶内网孔较分离胶网孔大，样品的移动速度较快，最终使样品“堆积”在浓缩胶和分离胶之间。 另外，浓缩胶还具有比分离胶更低的pH。浓缩胶内的缓冲溶液是Tris-HCl（pH 6.7)，分离胶内的缓冲溶液是pH 8.8的Tris-HCl，而电泳正负两极的缓冲溶液均为pH 8.3的Tris-甘氨酸缓冲溶液。在浓缩胶中，小分子并带有大量负电荷的Cl-在凝胶中的移动速率较快，而电荷较少且分子量较大的甘氨酸的移动速率较慢。由于二者在同一电场中，具有相同的电流，由此形成的电压梯度导致甘氨酸离子始终跟随在Cl-的后面，带有负电荷的蛋白质样品则浓缩在甘氨酸离子和Cl-之间向正极移动。当样品进入pH 8.8的分离胶时，甘氨酸的解离度增加，在电场中的迁移率高于样品，蛋白质不再夹于两种离子之间向正极移动，这时的蛋白质依靠分子筛效应和电荷效应???行分离。;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS(十二烷基硫酸钠)，是一种阴离子表面活性剂 ，在一定条件下它能打开蛋白质氢键和疏水键，并按比例地结合到这些蛋白质分子上形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，每克蛋白质一般结合1.4克SDS。SDS与蛋白质的定比结合使蛋白质-SDS复合物均带有相同的负电荷，其量远远超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了蛋白质间原有的电荷差异。 蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为1.8nm，而长轴则随蛋白质的分子量成正比变化。 蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是取决于椭圆棒的长度，也就是蛋白质相对分子质量。; 当蛋白质的分子量在15～200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关系，符合下列方程式 lgMW=-b·Mr+K 其中：MW为蛋白质分子量，Mr为相对迁移率，b为斜率，k为截距。在条件一定时，b和K均为常数。;实验仪器设备;电泳仪：;移液器：;实验试剂;分离胶和浓缩胶;实验操作;制备凝胶板;制分离胶：首先在小烧杯中配制分离胶，将配好的分离胶溶液用带蓝色枪头的移液枪从凝胶板一端缓慢加入两玻璃板之间之间的空隙，直至液面达到标记处。然后贴近胶液界面小心而缓慢地覆盖厚度约3～5mm的水层，以防止溶液蒸发并保证液面平整。静置聚合30～60min，凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 制浓缩胶：分离胶聚合好后，除去水层，并用滤纸条将水吸干。在小烧杯中配制浓缩胶，配好的浓缩胶溶液用带蓝色枪头的移液枪加在分离胶面上，充满制胶板，插入样品梳，静置聚合。;电泳;电泳：加样完毕，将电泳仪主体放入电泳槽中，加入电极缓冲溶液(高过短板)，电盖上盖子，将电泳仪的正负极与电泳仪正负极连接，打开电泳仪电源开关，开始时调节电流为10 mA/块，待样品进入分离胶后，将电流调至20 mA /块，电压恒定在80～100V，整个电泳保持电流强度恒定。当溴酚蓝染料距分离胶底部1 cm时，停止电泳，关闭电源。;染色与脱色;结果;标准蛋白;做标准曲线 以标准蛋白的迁移率为横坐标，以其对应的相对分子质量的对数为纵坐标 ，制作标准曲线， ;样品蛋白相对分子质量的确定： 根据未知样品迁移率，利用标准曲线计算样品相对分子质量。