03.生物技术药物的制造进程论述.ppt

;第一节生物技术药物生产简介; 获得目的的基因 ↓ 构建重组体 ↓ 构建基因工程菌(或工程细胞) ↓ 大规模培养工程菌 ↓ 产物分离纯化 ↓ 除菌过滤 ↓ 半成品检定 ↓ 制剂 ↓ 成品检定 ↓ 包装 生物技术药物生产一般过程;1、获得具有遗传信息的目的基因 从复杂的生物体基因组中采用不同方法分离并获得带有目的基因的DNA片段。获得目的基因主要通过下述方法。 (1)用限制性内切酶法直接分离目的基因 质粒和病毒等DNA分子小的几kb,大的几百kb,编码的基因较少,直接用限制性内切酶法获得目的基因 （2）人工合成目的基因 人工合成目的基因主要采用下列3种途径。 ①酶促方法 经提取获得编码基因的信息RNA（mRNA），在逆转录酶的作用下，合成互补DNA（cDNA）链，在DNA聚合酶I的作用下，加工成为双链DNA分子。 ②化学合成法 前提是必须已知基因的核苷酸序列，化学合成的DNA片段一般较短，需要用DNA连接酶进行连接，从而获得较长的DNA片段。 ③聚合酶链反应（PCR） 先决条件是必须已知基因的核苷酸序列，根据序列设计引物，进行PCR扩增获得的目的基因。也可以采用反转录PCR（RT-PCR）等方法，直接从富含目的基因的实验材料提取RNA，在逆转录酶的作用下获得cDNA，以此为模板进行PCR扩增获得目的基因。 (3) 构建基因组文库从cDNA文库分离目的基因 ;2、选择基因载体构建重组NDA 在体外将含目的基因的DNA片段和具有自我复制功能、并带有选择标记的载体分子进行酶切连接，获得重组DNA分子。常见基因载体有质粒、噬菌体（phage）、黏粒（cosmid）、病毒载体等。 3、将重组DNA分子导入宿主细胞 采用特定的方法将重组DNA分子转移至适当受体细胞（也称寄主细胞），并与之同步增殖。被导入的受体细胞分为两大类：第一类为原核细胞，目前常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等。第二类为真核细胞，其中真核微生物主要有酵母、丝状真菌等，此外为动物细胞、植物细胞。另外也可以导入动物和植物体。 导入的方法主要有转化、转染等方法，此外也可采用电融合、显微注射和基因枪等技术。 ;4、鉴定带有目的基因的克隆 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出克隆有重组DNA分子的寄主细胞。为了挑选出重组子，针对不同基因的表达产物，采用各自特有的测活方法确定其生物活性；也可以采用酶联免疫方法确定其抗原性；以目的基因为探针，通过DNA杂交方法可以直接确定重组子。 5、目的基因的扩增及获得目的产物 培养克隆有目的基因的重组子，提取获得扩增的目的基因以进行深入的研究。 将目的基因克隆至适当的表达载体，采用特定的方法将基因导入受体细胞，使其在新的遗传背景下获得活性表达，从而得到人类需要的特定目的物质;*;6、大规模培养工程菌 基因工程菌的培养过程主要包括： ①通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分析表达产物的合成、积累对受体菌的影响； ②通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案 及顺序。由于工程菌生长和异源基因表达之间有着较大的差异，各培养参数在全过程中必须分段控制。 在不同的发酵条件下，工程菌的代谢途径也不一样，因而对下游的纯化工艺会造成不同的影响。因此在高表达高密度发酵的前提下，还要尽量建立有利于纯化的发酵工艺，以提高产品的纯度及改善其性质。;7、根据研制产品的物理化学性质,选择合理的分离纯化方法 基因工程产物分离纯化的费用约占整个生产费用的80%～90%，因此，该工艺过程理所当然地应受到高度的重视。然而基因工程产物的分离纯化过程与传统发酵产物相比，具有下列特点：（1）产物大多处于细胞内，提取前需将细胞破碎，增加了很多困难；（2）产物浓度较低、杂质多、而最后成品要求达到的纯度高，故提取较困难，且收率低，常需好几步操作并需采用高分辨力的精制方法；（3）产物都是大分子蛋白质，通常不稳定，遇热、极端pH、有机溶剂和剪切力等易引起失活。各种产物表达形式所采用的分离纯化方法不同。 纯化方法对重组蛋白的化学性质、构象等都有重要影响，合理的纯化方法至少要包括以下几方面: 纯化步骤少 产物的纯度、活性及其他检测指标达到规定要求 得率高 在确定纯化工艺时要多借鉴最新的分离纯化技术并计算相关技术成本,要考虑到将来生产工艺放大以后的可行性，在研制阶段所得出的实验数据,要为将来的生产放大提供充分的依据。 在现实中,有许多厂家，企业拿到某种产品的新药证书和生产批文,但市场上迟迟见不到该品种上市的现象比比皆是，除生产厂家有自己的产品上市销售安排之外,生产工艺先天不足也是一个主要的原因。 ;分离纯化的一般流程;;NDV-F（新城疫弱毒株）诱生人脐血干细胞，提取mRNA，反转录成DNA，构建质粒，经克隆筛选获得有目的基因的质粒pBV867,转化到大肠