丙种球蛋白的制备.ppt

;丙种球蛋白概念;（2）药理作用;（3）适应症;制备丙种球蛋白的方法;电泳;;聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： 凝胶透明，有弹性，机械性能好； 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应； 对pH和温度变化较稳定,几乎无吸附和电渗作用； 样品用量少，灵敏度可达10-6g; 凝胶孔径可调节； 分辨率高。 凝胶系统的分类;1、连续性凝胶电泳 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同， 带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度 及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不 仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应。;2、不连续凝胶电泳 垂直电泳原理 阴极电泳用水溶性树脂是一种阳离子型化合物，用 有机酸中和，在水中溶解后，以分子和离子平衡状 态存在于直流电场中，两极产生电位差，离子发生 定向移动，阳离子向阴极移动，并在阴极表面上得 到电子沉积于阴极表面，而阴离子向阳极移动，在 阳极上放出电子氧化成酸。这就是电泳涂装的基本 原理。它是一个非常复杂的电化学反应，其中包括： 电解、电泳、电沉积、电渗四个同时进行的过程。;实验步骤;(4)染色和脱色 电泳结束时,用双蒸水把胶面洗净。臵于染 色液(0.1%甲醇,0.5%三氯乙酸,0.1%考马斯 亮蓝G250)中,50～60r/min,振荡染色1h。 然后用双蒸水洗净胶面,转至双蒸水脱色,1h。 更换双蒸水2~3ci直到背景清晰。 盘状电泳 圆盘电泳是带电粒子(胶体颗粒、离子等)在电场的 作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极 方向定向泳动的现象.广泛应用于生物大分子的分离 和鉴定。 它是利用丙烯酰胺和双丙烯酰胺在催化剂的作用下 聚合成大分子的凝胶物。它同时兼有分子筛和电泳 效应。当样品通过凝胶进行电泳时，便可以根据其 样品中各分子的电荷和分子量的不同而泳动出不同 的区带。由于聚丙烯酰胺凝胶化学性质较琼脂稳定， 很少带有侧基，在电泳过程中，吸附作用与电渗作 用均小，所以该技术的分辨率均高于其它琼脂电泳 技术。;聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应;;材料与试剂;五、操作步骤;3、加样： 取一根上次做好的凝胶小玻管用吸水纸???轻吸去 浓缩胶表面上的水层，然后用微量注射器加10ul测 试样品溶液。 4、装置凝胶管： 将加好样品的凝胶管的加样端（上端），插入上电 泳槽孔中，然后将已插满凝胶管的上电泳槽放入加有 电极溶液的下电泳槽内。此时凝胶玻管下端管口易产 生气泡，可通过轻轻摆动凝胶玻管以去除气泡，插入 上电泳槽的玻管上端，用滴管轻轻滴满电极溶液，以 免产生气泡，最后将上电泳槽装满电极液。 ;5、接通电源： 接通电泳槽的两端电极与电泳仪的电源，上槽电极接 负极，下槽电极接正极，稳压300V电泳开始时，电流 应由小逐步加大至额定值。这时的电流大约每管3.05.0 mA 电流，直至指示剂前沿到达凝胶管底部约0.5 cm处，（大约需时2小时），停止电泳。确定电泳结 束时，不应将溴酚兰跑出凝胶管，以防止标准分子量 中的最低分子量蛋白质也跑出凝胶管。 6、练习取出玻管内的凝胶： 将一支带有长针头的注射器吸有适量水（蒸馏水 或自来水），把针头慢慢插入玻管内壁和凝胶柱表 面之间，一边开始压水，一边同时使针头慢慢贴紧 管壁呈螺旋式前进，如果一端不行，再在管的另一 端按同样的方法剥离，这样依靠水流的压力和滑润 力，使玻管内壁与凝胶分离，最后用洗耳球在管的 一端轻轻挤压，另一端对着一干净大小适宜的培养 皿内，此时可以将凝胶柱压出玻管。;7、取出玻管内的凝胶 8、凝胶染色： 将取出的凝胶柱，放入一合适干净的培养皿内，然 后加入适量染色液，于摇床上进行振摇染色30分钟， 完毕，回收染色液，用清水洗凝胶柱2-3遍。在染色的 同时，凝胶中蛋白质区带亦被固定。 9、凝胶脱色： 在培养皿（或试管）内加入适量脱色液于摇床上进 行振摇（2小时/次，需3次）脱色多次直至色带完全清 晰为止。 10、绘图： 最后根据染色所出现的带数和位置进行绘图， 以确定被分析样品的组分。另一种方法是通 过密度扫描仪扫出各组分的峰形位置，这样 不仅能确定组分，而且能比较出各组分所占 比例（如果要计算出各分离区带的相对迁移 率，可参考教课书）。;注意事项 样品的离子强度、pH值尽可能与浓缩胶溶液相同， 如含大量盐类时，应透析除盐。最适合的样品蛋白 量是10μg～100μg，加入样品量要少，血清样品 3μl～5μl，免疫球蛋白样品可加15μl～20μl。 凝胶柱面应平整，操作过程切勿产生气泡，否则电 泳区带不整齐。 电泳中电流应保持稳定，避免电流强度过高，而产 生大量的热使分离失败。 电泳开始，样品应于5min～10min内进入凝胶柱内 为佳。 药品大部???有毒，应注意防护。 友情提示: 分 离 胶: 7.0 C