兔血清醋酸纤维薄膜电泳实验.ppt

兔血清醋酸纤维薄膜电泳实验XXX;实验目的; 血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质, 约占总量的60%，牛血清白蛋白分子量约66.2kDa。它是一种水溶性很强的蛋白, 结构稳定, 能结合多种小分子, 如脂肪酸, 胆红素, 血红素等, 起维持血液的正常渗透压作用. ;分离纯化的意义;分离纯化的要求;分离纯化的一般程序;1. 粗提;2. 脱盐;透析原理： 通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。 ;操作： 新透析袋用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净，即可使用。 使用时，一端用橡皮筋或线绳扎紧，也可以使用特制的透析袋夹夹紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，通常要留三分之一至一半的空间。 在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。放入盛有蒸馏水的大烧杯中，磁子搅拌，于4 ℃透析过夜,按时更换透析液。 检查透析效果：1％ BaCl2检查(NH4)2SO4;3. 纯 化;;三、纯化（阴离子交换层析）;原理： 　　蛋白质是两性电解质。当PHPI时，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动；当PHPI时，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动。血清中含有数种蛋白质，在同一PH值时，因所带电荷不同，而在电场中的移动速度也不相同，故可用电泳法将其分离。白蛋白等电点低于pH7.0，在缓冲液中（pH8.6）中，电离成负离子，在电场中向阳极移动。 本试验以牛血清为材料，醋酸纤维薄膜为支持物，通过点样、电泳、染色、脱色从而得到白蛋白质的分离图谱，再进行观察和定量分析。;准备：制作电桥 将巴比妥缓冲液(pH=8.6)倒入电泳槽内，两槽缓冲液平衡至同一水平面。两电极槽各放入两层滤纸，一端浸入缓冲液中，另一端贴附在电泳槽支架上，它们的作用是联系薄膜与两极缓冲液之间的中间“桥梁”。;1、润湿：用镊子取薄膜一条，浸入缓冲液中，完全浸透后（大约3-5分钟），用镊子取出，将无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，将滤纸对折，吸取多余的缓冲液（注意不要吸的太干）。 2、点样：点样时，先用吸管将3微升血清均匀地涂在点样器表面，再用点样器“印”在薄膜的点样区内，样品呈线状，宽约1-2mm。 注意：点样时动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。另外操作过程要防止指纹污染。;3、电泳：将薄膜平贴于放在电泳槽上并已浸透缓冲液的滤纸上，无光泽面要向下放置，点样端放在阴极，进行电泳。电泳条件：电压90-110V，电流0.4-0.6A，通电60分钟。至氨基黑指示剂迁移至距薄膜底部前沿时, 停止电泳。 4、染色：电泳完毕，将薄膜浸入染色液（回收）中10分钟，进行染色。 5、漂洗：用漂洗液漂洗，不停摆动薄膜条，每3-5min左右换一次液，连续更换三次，可使背景颜色脱去。将膜夹在干净滤纸中，吸去多余溶液。 操作中，注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。 6、透明：将薄膜用滤纸吸干或吹风机吹干，浸入透明液中，2min立即取出，紧贴：在载物片上，赶走气泡。完全干燥后，薄膜完全透明，可??扫描描或照相，将该玻璃板浸入水中，则透明的薄膜可脱下，吸干水分，可长期保存。 ;结果与分析;醋酸纤维薄膜电泳的注意事项;作业: 撰写实验报告