新植物多靶点CRISPR-Cas9载体使用方法(2015-5-1)资料.doc

PAGE \* MERGEFORMAT 5CRISPR/Cas9-based genome editing technologyA robust CRISPR/Cas9 vector system for multiplex targeting of genomic sites in monocot and dicot plants亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室华南农业大学生命科学学院刘耀光课题组(ygliu@)pYLCRISPR/Cas9多靶点载体介绍CRISPR/Cas9是新近发展的基因组编辑技术（图1）。CRISPR/Cas9切割靶序列仅需要single-guide RNA (sgRNA)以及由sgRNA引导的Cas9蛋白，比锌指核酸酶（ZFNs），TALENs更加简便，高效，因而成为基因组编辑工具的首选。我们利用CRISPR/Cas9技术可方便地进行多重靶向的特征，构建了一套用于单子叶和双子叶植物的多靶点CRISPR/Cas9基因打靶载体系统。本套载体将Cas9蛋白表达盒整合到双元载体上，用于装载多个sgRNA表达盒的多克隆位点Bsa I位于靠近双元载体RB位置。sgRNA表达盒元件设在中间质粒载体上，利用酶切连接和PCR方法拼装好，再利用Golden Gate或Gibson Assembly克隆方法组装到双元载体上。本载体系统已经发表（Ma et al., 2015, Molecular Plant, DOI:10.1016/j.molp.2015.04.007）。Figure 1. A working model of the CRISPR/Cas9 system. The Cas9-sgRNA complex locates to the target site to cleave the DNA to produce double strand break (DSB).2．CRISPR/Cas9载体与sgRNA载体图谱2.1CRISPR/Cas9双元载体本套载体系统的双元载体骨架为pCAMBIA-1300 (ACCESSION: AF234296)，Cas9p为本实验室设计合成的植物优化密码子基因，它模拟了禾本科植物基因具有5’端GC含量较高的特征 (Figure 2)。这些质粒在E. coli TOP10F’(LacIq) 菌株繁殖，该菌株LacIq基因型产生的阻碍蛋白可抑制ccdB大肠杆菌致死基因的表达。我们对pYLCRISPR/Cas9载体采用了新的命名，与旧的命名对应关系见表1。pYLCRISPR/Cas9Pubi-H, -B载体中的Cas9p用PUbi驱动，优选用于单子叶植物的基因打靶；对于双子叶植物，我们前期使用pYLCRISPR/Cas9P35S-H在拟南芥获得了uniform简单突变（双等位突变，杂合突变，纯合突变）以及嵌合突变（Ma et al., 2015）。但是，我们最近发现用pYLCRISPR/Cas9Pubi-H在拟南芥的打靶效果效率比使用pYLCRISPR/Cas9P35S-H的效果效率更高，能得到更多的简单突变。因此也推荐在双子叶植物优先使用PUbi驱动Cas9p的载体pYLCRISPR/Cas9P35S-H或pYLCRISPR/Cas9P35S-B。Figure 2. A CRISPR/Cas9 system for monocot and dicot plants.pYLCRISPR/Cas9Pubi-H, -B (above); pYLCRISPR/Cas9P35S-H, -N,-B (below); HPT (-H), Bar (-B), and NPT II (-N) encode hygromycin B phosphotransferase, PPT acetyltransferase and neomycin phosphotransferase II, respectively. NLS, nuclear localization sequence. The key sequences including restriction sites for cloning and analysis of sgRNA expression cassettes are given. Two Bsa I-cutting sties [Bsa I (B-L) and Bsa I (B-R)] for cloning the sgRNA expression cassettes are separated by a shorten form of the ccdB negative selection gene.表一 pYLCRISPR/Cas9载体新旧命名对