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华南师范大学生命科学学院 范瑞芳; 有机化合物的紫外—可见吸收光谱，是其分子中外层价电子跃迁的结果（三种）：σ电子、π电子、n电子。;?⑴　σ→σ＊跃迁;? ⑶ π→π＊跃迁 所需能量较小，吸收波长处于远紫外区的近紫外端或近紫外区，摩尔吸光系数εmax一般在104L·mol－1·cm－1以上，属于强吸收。不饱和烃、共轭烯烃和芳香烃类均可发生该类跃迁。如：乙烯π→π*跃迁的λ为162 nm，第一节 紫外—可见吸收光谱为: 1×104 L· mol-1·cm－1。;二、生色团与助色团;由于取代基或溶剂的影响造成有机化合物结构的变化，使 吸收峰向长波方向移动的现象称为吸收峰“红移”。 能使有机化合物的λmax 向长波方向移动的基团（如助色团、生色团）称为向红基团。 由于取代基或溶液的影响造成有机化合物结构的变化，使 吸收峰向短波方向移动的现象称为吸收峰“蓝移”。 能使有机化合物的λmax 向短波方向移动的基团（如-CH3，-O-CO-CH3等）称为向蓝基团。;π→π*跃迁可以发生在任何具有不饱和键的有机化合物分子中，其最大摩尔吸光率很大，吸收峰随溶剂极性增加向长波方向移动，即产生红移。 下表列出了一些常见生色团π→π*跃迁的吸收特性。;另有一些基团，本身并不产生吸收峰，但与生色团共存于同一分子时，可引起吸收峰的位移和吸收强度的改变，这些基团称为助色团。如苯环的一个氢原子被一些基团取代后，苯环在254nm处的吸收带的最大吸收位置和强度就会改变。;当一个分子中含有两个或两个以上的生色团时，按相互间的位置可以分为共轭和非共轭两种情况：非共轭时，各个生色团各自独立吸收，吸收带由各生色团的吸收带叠加而成；共轭时，生色团原有的吸收峰会发生改变，可产生新的吸收峰。下表列出了一些有关共轭结构的化合物的吸收特性。;四、常见有机化合物紫外吸收光谱;五、影响紫外-可见吸收光谱的因素;图4 红茶样品与标样1（波长：196nm;流动相：乙腈∶1%磷酸水溶液=5∶95（体积比） a为标样1的色谱曲线 b为红茶样品12的色谱曲线 ;图a, b,c为不同浓度茶氨酸标样在在196nm下的色谱图。(茶氨酸标样用甲醇溶剂配制）。 图d为甲醇在196nm下的色谱图。 ;第二节 紫外吸收光谱的应用; 紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。 例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明该物质无共轭结构和芳香结构。;1.3化合物纯度的检测 用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便的。 如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用A280/A260的比值，鉴定其纯度。 ;（1）待上样： （2）上样： （3）上样30min （4）上样60min ;可见A618.5nm时出现峰值1.555，又由于A258.5nm和A310.5时出现峰值2.476和0.491，且两点间近似于直线关系，于是可得A280nm约等于1.655。最终A618.5/ A280=0.94。所得纯度与一般认可值4相比较低。 ;二、朗伯-比尔定律 朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即 A= κ cl 式中比例常数κ与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l为透光液层厚度。 ;三、吸光系数;四、偏离朗伯-比耳定律的因素;为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好的单色器。此外还应将入射波长选定???待测物质的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处。;（2）溶液的不均性。 实际样品的混浊，加入的保护胶体，蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发射等，均可吸光质点的吸光特性变化大。;pH=7.5的缓冲液 定容至25mL 在540nm处测定;*;*;第三节紫外-可见分光光度计; 在紫外可见分光光度计中，常用的光源有两类：热辐射光源和气体放电光源。 ; 吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外区。 ;检测器 检测器的作用是检测光信号，并将光信号转变为电信号。现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。