生化仪器分析复习资料-101.doc

生化仪器分析复习资料 分子内部三种运动形式，对应的能级 分子内电子相对原子核的运动（称为电子运动）——电子能级 分子内原子在其平衡位置上的振动（称分子振动）——振动能级 以及分子本身绕其重心的转动（称分子转动）——转动能级 分子轨道的四种跃迁，其中属于紫外-可见光谱电子跃迁类型是 （1）σ→σ*跃迁 所需能量最大，σ电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁。饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区(吸收波长λ200nm，只能被真空紫外分光光度计检测到) 甲烷：λmax=125 nm 乙烷：λmax=135 nm 该类化合物的紫外-可见吸收光谱应用价值很小。 （2） n→σ*跃迁 所需能量较大。吸收波长为150～250nm，大部分在远紫外区，近紫外区仍不易观察到。含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O、S和卤素等杂原子)均呈现n→σ* 跃迁。 CH3OH：λmax=183 nm 、CH3NH：λmax=213 nm 大多数吸收峰λmax小于200nm，难以检测到 （3）π→π*跃迁（紫外-可见光谱电子跃迁类型） 所需能量较小，吸收波长处于近紫外区， λmax ~200nm 摩尔吸光系数 εmax≥104，属于强吸收。不饱和烃、共轭烯烃和芳香烃类均可发生该类跃迁 （4）n→π*跃迁（紫外-可见光谱电子跃迁类型） 需能量最低，吸收波长λ200nm。是生色团中的未成键孤对电子向π*轨道跃迁。 属于禁阻助跃迁， εmax＜ 100，是弱吸收带。 生色团、助色团、红移、蓝移、增色效应、减色效应 生色团 最有用的紫外—可见光谱是由π→π*和n→π*跃迁产生的。这两种跃迁均要求有机物分子中含有不饱和基团。 这类含有π键的不饱和基团称为生色团。 简单的生色团由双键或叁键体系组成，如乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮基—N＝N—、乙炔基、腈基—C三N等。 助色团 有一些含有n非成键电子对的基团(如—OH、—OR、—NH２、—NHR、—X等)，它们本身没有生色功能(不能吸收λ200 nm的光)，但当它们与生色团相连时，就会发生n—π共轭作用，增强生色团的生色能力(吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的基团称为助色团。 红移 由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移（长移）； 蓝移：吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移） 增色效应：吸收强度增强的效应 减色效应：吸收强度减小的效应 饱和烃化合物、不饱和烃化合物紫外-可见吸收光谱的特点，蛋白质、核酸的紫外可见吸收光区 饱和烃及取代烃 饱和单键碳氢化合物含有C-H和C-C键，只含有σ键电子, 一般在远紫外区才有吸收，又称为真空紫外区；因为小于160nm的紫外光要被空气中的氧所吸收，因此需要在无氧或真空中进行测定，所以应用不多；这类化合物在紫外吸收光谱中常用作溶剂，如己烷，庚烷，环己烷等 不饱和烃及共轭烯烃 这类化合物含有孤立双键和共轭双键，都含有π电子，吸收能量后可产生π－π*跃迁 由共轭双键（两个双键被一个单键隔开时称为共轭体系）中跃迁产生的吸收带称为K（π－π*）带 特点：强度大，摩尔吸收系数大，通常在104－2×104 L mol-1cm-1，吸收峰的位置一般在217－280nm；K吸收带的波长和强度与共轭体系的数目，位置和取代基的种类有关 蛋白质紫外吸收光谱 ? 构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。 ? 在近紫外区(220-300nm)只有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸有吸收光的能力。 ? 苯丙氨酸的lmax＝257nm，酪氨酸的lmax＝275nm，色氨酸的lmax＝280nm 核酸紫外吸收 由于嘌呤碱和嘧啶碱紫外线吸收特性，所以核酸分子具有紫外吸收性质 一般在260nm左右有最大吸收峰（蛋白质在280nm），可以作为核酸及其组分定性和定量测定的依据 透光度和吸光度的关系，朗伯-比尔定律的公式，注意ε和a分别表示什么 透过光的强度(Ⅰt)和入射光强度(Ⅰo)之比称为透光度（T)： T=Ⅰt / Ⅰo ? 为表示物质吸收光的程度引入吸光度(A)概念： 朗伯-比尔定律的公式：A=εbc=abc( 波长一定） 当b以cm, c以g/L为单位时, 吸光系数以a表示: a=A/(bc) 当b以cm, c以mol/L为单位时, 摩尔吸光系数以ε表示：ε=A/(bc) 偏离朗伯-比尔定律的因素（单色光和溶液的浓度） 光学因素 非单色光的影响： Lamber-Beer定律应用的重要前提——入射光为单色光。一般仪器所获得的入射光是具有一定波长范围的复合光，由于物质对不同波长的光有不同的吸光系数，从而使得吸光度的变化偏离Lamber-Beer定律 消除方法：选择较窄的入射狭缝宽度和提高单色器分辨率决定