第六章 核酸序列分析.pptVIP

第六章 核酸序列分析;一、核酸多态性分析;长度多态性：数目可变的串联重复序列(variable number of tandem repeat，VNTR)多态性;单核苷酸多态性，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA顺序多态性。它是人类可遗传变异中最常见的一种，占所有已知，多态性的90％以上。估计人类基因组中有300万个，平均1个SNP/500-1000个碱基。 SNP既可存在于基因顺序内，也可存在一基因以外的非编码顺序中。存在于编码顺序中的SNP虽然较少，但其在遗传疾病研究中却具有重要意义。相当一部分SNP直接或间接地与个体间的表型差异、人类对疾病的易感性和抵抗能力有关，因此，对SNP的研究越来越受到人们的关注。 ;DNA长度多态性分析 ; 对RFLP的检测主要是用Southern杂交的方法进行，即利用限制酶酶解及凝胶电泳分离不同生物体的DNA分子，然后用经标记的特异DNA探针与之杂交，通过发射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性。 ;;Southern blot; RFLP技术重要应用之一为疾病的诊断。通过RFLP技术，并与正常人的RFLP测定结果比对，能够确定某种疾病状态下特有的RFLP特异性疾病标记。 因此，通过特异性疾病标记的分析，能够对某种疾病进行分子诊断。;RFLP应用举例：地中海贫血;②RAPD（random amplified polymorphic DNA）标记： 随机扩增多态性DNA，用随机短引物（人工合成的六核苷酸）进行DNA的PCR扩增。所扩增的DNA区段是事先未知的，具有随机性和任意性，因此随机引物PCR标记技术可用于对任何未知基因组的研究。;③SSR（simple sequence repeats)标记:简单重复序列多态性。 微卫星DNA（Microsatellite DNA）又称短串联重复或简单重复序列，最先是1981年由Miesfeld等从人类基因组文库中发现。随后人们发现这种简单重复序列广泛存在于各类真核生物的基因组中。 微卫星DNA是由一段DNA简单重复模块串联组成的长达几十个核苷酸的重复序列，重复单位为数个核苷酸长度的序列，重复次数从几次到几十次不等，重复总长度一般小于100个碱基对。目前广泛研究和应用的微卫星重复单位为2～4个核苷酸。 单一型：ATATATATATATATATATATATAT 　　 复合型：ATATATCACACACACACACAC 　　 间断型：ATATATCA ATATATCA ATATATA;微卫星筛选流程筛选;（基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记） ④AFLP（amplified fragments length polymorphism）标记：扩增片段长度多态性。通过对基因组DNA酶切片段的选择性扩增来检测DNA酶切片段长度的多态性。AFLP揭示的DNA多态性是酶切位点和其后的选择性碱基的变异。AFLP 原理 AFLP技术的优点是该技术结合了RFLP的稳定性和PCR技术的高效性，又同时克服了RFLP带型少，信息量小以及RAPD标记对条件比较敏感的缺点。;;（单核苷酸多态性的DNA标记） ⑤SNP（single nucleotide polymorphism）标记: 单核苷酸多态性。不同个体基因组DNA序列同一位置上的单个核苷酸的差别。其比较的不是DNA的片段长度，而是相同序列长度里的单个碱基的差别。;SNP检测方法;;PCR-SSCP：;;二、DNA序列测定;杂交测序法 质谱法 单分子测序法 原子探针显微镜测序法 流式细胞仪测序法 大规模平行实测法、 DNA 芯片法 ;与 PCR反应类似。 反应体系中包含：模板 DNA, Taq酶, dNTPs, ddNTPs和测序引物； 反应过程： 变性－复性－延伸－终止 ;ddNTPs 是反应终止剂 可以当作正常碱基参与复制 一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。 反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs(一般1:3~4)。;双脱氧核苷三磷酸; 如果在DNA的合成反应中，除了加入4种正常的脱氧核苷三磷酸（dNTP）外，再加入一种少量的2’,3’-ddNTP，那么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，所以反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。 在4组独立的DNA合成反应中，分别加入4种不同的ddNTP，结果将生成4组核苷酸链，它们将分别（随机）终止于每一个A，每一个G，每一个C，每一个T的位置上。对这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。;Sanger双脱氧测序方法示意图;M