08-分子克隆实验设计.ppt

分子克隆实验原理;;分子克隆实验原理;菌种保存和活化;质粒的提取原理－碱裂解法;质粒的提取原理－碱裂解法;质粒的保存;感受态细胞的制备;载体的制备;基因的制备(*);连接;转化;重组克隆的筛选*;抗性筛选--质粒载体携带的筛选标记;蓝白斑筛选－－β半乳糖苷酶（Lac Z)的显色反应;;酶切电泳筛选(*);PCR筛选;测序验证;1、一次测序反应一般准确测定500bp左右(也有测准800bp,价格贵）－－60元左右。 2、测定的序列靠近引物（起点）20~30bp不准，500bp后的序列也不准。 3、（1）质粒测序： 测序引物公司提供 （2）PCR产物直接测序： 测序引物自己提供，理论上比质粒测序更可靠。 注意: A. 测序引物必须与模板完全配对；含有mix碱基的引物一般不能测序； B. 测序引物长度一般为20个碱基左右，GC含量必须在50％～60%左右。 ;;表达筛选;SDS筛选;亲和筛选;免疫筛选;生物活性筛选;分子克隆流程