基因工程制药绪论.ppt

生物制药;第二章 基因工程制药;第一节 概述;基因工程技术所生产的药物;基因工程技术的应用特点;基因工程制药的优点;第二节 基因工程药物生产的过程;制备基因工程药物的基本过程;基因工程药物生产的上游和下游;基因工程药物生产的上游;基因工程药物生产的上游和下游;第三节 目的基因的获得;第三节 目的基因的获得;一、反转录法 为了克隆编码某种特异蛋白质 多肽的DNA序列，可以从产生该蛋 白质的真核细胞中提取mRNA, 以 其为模板，在反转录酶的作用下， 反转录生成该蛋白质mRNA互补 DNA（cDNA第一链），再以cDNA 第一链为模板，在DNA聚合酶Ⅰ作 用下，最终合成编码该多肽的双链 DNA序列。;1. mRNA的纯化 a. 细胞内RNA的组成和含量： DNA：95%核内，5%细胞器 RNA：75%细胞质，10%核内，15%细胞器 rRNA80~85%；tRNA10~15% ； mRNA2~5% b. 真核细胞mRNA的特点及分离纯化方法 3′-polyA（20~250AAA）-oligo（dT） ;2.cDNA第一链的合成 一般mRNA都带有3’-polyA，所以可 用寡聚(dt)作为引物，在反转录酶催化 下，合成cDNA链。 3.cDNA第二链的合成 以第一链为模板，从发夹结构开始合成。 DNA聚合酶Ⅰ-----合成cDNA第二链 核酸酶S1-----切除发夹结构; 载体的选择依据之二： cDNA插入片段小于10kb---质粒载体 大于10kb---噬菌体载体;pBR322质粒图谱;cDNA片段与载体的连接;5.将重组体导入宿主细胞 6.cDNA文库的鉴定 根据重组体的表型进行筛选，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑颜色改变法。然后采用凝胶电泳、分子杂交、DNA序列分析测定等方法进行进一步筛选和鉴定。;7.目的cDNA克隆的分离和鉴定 （1）核酸探针杂交法。根据目的蛋白质纯品的氨基酸序列分析结果，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。 （2）免疫反应鉴定法。用表达型载体构建的cDNA文库，可用免疫学方法分组逐一鉴定各cDNA的表达产物，即以某种蛋白质的抗体寻找相应的特异cDNA克隆。 鉴定：杂交分析、基因定位、基因测序等;反转录法的优缺点;二、反转录PCR 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模 板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA 第一链（不需要合成cDNA第二链），再以cDNA第一链为 模板进行PCR扩增，而获得目 的基因，用于重组、克隆。 ;三、化学合成法 先决条件：已知核苷酸序列；或已知其蛋白质的氨 基酸序列，再推导出核苷酸序列 人工化学合成的限制： 一是不能合成太长的基因，不超过60bp； 二是遗传密码的简并性可导致中性突变； 三是费用较高。;第四节 基因表达;第四节 基因表达;一、宿主菌的选择 宿主菌应满足以下要求： 具有高浓度、高产量、高产率； 能利用易得廉价原料； 不致病、不产生内毒素； 发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态； 容易进行代谢调控； 容易进行重组DNA技术； 产物容易提取纯化。;宿主细胞的分类： 原核细胞，常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等； 真核细胞，常用的有酵母、丝状真菌等。 1.原核细胞 （1）大肠杆菌 表达产物的形式：细胞内不溶性表达(包含体)、胞内可溶性表达、细胞周质表达，极少数情况下也可分泌到细胞外。不同的表达形式具有不同的表达水平及完全不同的杂质。;大肠杆菌中表达的特点： A、由于没有信号肽，大肠杆菌中的产物多为胞内产物，提取时需破碎细胞，导致细胞质内其他蛋白质也释放出来，造成提取困难。 B、由于分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物须在下游处理过程中，经过变性和复性处理才能恢复其生物活性； ;C、在大肠杆菌中表达时，不存在翻译后修饰作用，故对蛋白质产物不能糖基化，因此只适用于表达不经糖基化等翻译后修饰仍具有生物功能的真核蛋白质，在应用上受到一定的限制。 D、由于翻译常从编码甲硫氨酸的AUG密码子开始，目的蛋白质的N端常多一个甲硫氨酸残基，会引起免疫反应。大肠杆菌会产生很难除去的内毒素，还会产生蛋白酶破坏目的蛋白质。;（2）枯草芽孢杆菌 分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌 到培养液中，不形成包含体； 不能使蛋白质糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行